TRANSKRIPTOMİKA
təbiət
Kommunikasiyalar
Xroniki lenfositik lösemidə SF3B1 mutasiyasının tam uzunluqlu transkript xarakteristikası saxlanılan intronların aşağı tənzimlənməsini aşkar edir.
Tam metrajlı transkriptlər|Nanopore sequencing|Alternativ izoform analizi
Fon
SSF3B1 splaysinq faktorunda omatik mutasiyaların müxtəlif xərçəng növləri, o cümlədən xroniki limfositik leykemiya (CLL), uveal melanoma, döş xərçəngi və s. ilə əlaqəli olduğu geniş şəkildə bildirilmişdir. Bundan əlavə, qısa müddət ərzində oxunan transkriptomik tədqiqatlar SF3B1 mutasiyaları tərəfindən törədilən aberrant splicing modellərini aşkar etmişdir.Bununla belə, bu alternativ birləşdirmə nümunələri üzrə tədqiqatlar uzun müddətdir ki, qısa oxunan yığılmış transkriptlərin məhdudlaşdırılması səbəbindən hadisə səviyyəsində və izoform səviyyəsində bilik çatışmazlığı ilə məhdudlaşır.Burada tam uzunluqlu transkriptlər yaratmaq üçün nanopore sequencing platforması təqdim edildi ki, bu da AS izoformaları üzərində araşdırma aparmağa imkan verdi.
Eksperimental Dizayn
Təcrübələr
Qruplaşdırma:1. CLL-SF3B1(WT) 2. CLL-SF3B1(K700E mutasiyası);3. Normal B-hüceyrələri
Ardıcıllıq strategiyası:MinION 2D kitabxana ardıcıllığı, PromethION 1D kitabxana ardıcıllığı;eyni nümunələrdən qısa oxunuş məlumatları
Sıralama platforması:ONT MinION;ONT PromethION;
Bioinformatika təhlili
Nəticələr
A6 CLL nümunəsi və 3 B hüceyrəsindən cəmi 257 milyon oxunuş əldə edilmişdir.Bu oxunuşların orta hesabla 30,5%-i tammetrajlı transkriptlər kimi müəyyən edilib.
FRNT-nin uzunmüddətli alternativ izoform analizi (FLAIR) yüksək etibarlı izoformalar toplusunu yaratmaq üçün hazırlanmışdır.FLAIR aşağıdakı kimi ümumiləşdirilə bilər:
Nanopore oxuyur hizalama: istinad genomuna əsaslanaraq ümumi transkript strukturunu müəyyənləşdirin;
Splice qovşağının korreksiyası: ya annotasiya edilmiş intronlardan, qısa oxunan məlumatlardan intronlardan və ya hər ikisindən birləşmə yeri ilə ardıcıl səhvləri (qırmızı) düzəldin;
Collapse: birləşmə zəncirlərinə əsaslanan təmsilçi izoformaları ümumiləşdirin (ilk keçid dəsti).Dəstəkləyici oxunuşların sayına əsasən yüksək inamlı izofrom seçin (Hər həd: 3).
Şəkil 1. CLL-də SF3B1 mutasiyası ilə əlaqəli tam uzunluqlu izoformları müəyyən etmək üçün FLAIR analizi
FLAIR 326,699 yüksək etibarlı birləşdirilmiş izoformları müəyyən etdi, bunların 90%-i yeni izoformlardır.Bu qeyd olunmamış izoformaların əksəriyyətinin məlum birləşmə birləşmələrinin (142,971) yeni birləşmələri olduğu aşkar edildi, qalan yeni izoformlarda isə ya saxlanılmış intron (21,700) və ya yeni ekson (3594) var idi.
Long-oxumaq ardıcıllığı izoform səviyyəsində mutant SF3B1-K700E dəyişdirilmiş birləşmə yerlərinin identifikasiyasına imkan verir.35 alternativ 3'SS və 10 alternativ 5'SS-nin SF3B1-K700E və SF3B1-WT arasında əhəmiyyətli dərəcədə fərqləndiyi aşkar edildi.35 dəyişiklikdən 33-ü uzun müddət oxunan ardıcıllıqla yeni kəşf edildi.Nanopore məlumatlarında, SF3B1-K700E ilə dəyişdirilmiş 3'SS-lər arasındakı məsafənin kanonik saytların zirvələrinə paylanması təxminən -20 bp təşkil edir ki, bu da CLL qısa oxunma ardıcıllığında bildirilənlərə bənzər nəzarət paylanmasından əhəmiyyətli dərəcədə fərqlənir.ERGIC3 geninin izoformları təhlil edildi, burada proksimal birləşmə yerini ehtiva edən yeni bir izoform SF3B1-K700E-də daha çox tapıldı.Həm proksimal, həm də distal 3'SS çoxlu izoformalar yaradan fərqli AS nümunələri ilə əlaqələndirildi.
Şəkil 2. Nanoporə ardıcıllığı məlumatları ilə müəyyən edilmiş alternativ 3′ splicing nümunələri
IR hadisəsinin istifadə təhlili, IR identifikasiyası və kəmiyyətinin müəyyən edilməsinə olan inam səbəbindən qısa oxunama əsaslanan təhlildə çoxdan məhduddur.SF3B1-K700E və SF3B1-WT-də İQ izoformalarının ifadəsi nanoporə ardıcıllığı əsasında ölçüldü və SF3B1-K700E-də İQ izoformalarının qlobal aşağı tənzimləməsini aşkar etdi.
Şəkil 4. Kənd təsərrüfatının intensivliyi və üç kənd təsərrüfatı sistemi (A və B) üzrə şəbəkə bağlantısı;Təsadüfi meşə təhlili (C) və kənd təsərrüfatı intensivliyi ilə AMF kolonizasiyası arasında əlaqə (D)
Şəkil 3. CLL SF3B1-K700E-də intron icarəsi hadisələri daha güclü şəkildə aşağı tənzimlənir
Texnologiya
Nanopore Uzun Oxunan Sıralama
Nanopore sequencing tək molekullu real vaxt elektrik siqnalı ardıcıllığı texnologiyasıdır.
Diki zəncirli DNT və ya RNT biofilmdə yerləşdirilmiş nanoməsaməli zülala bağlanacaq və motor zülalının rəhbərliyi altında açılacaq.
DNA/RNT zəncirləri gərginlik fərqinin təsiri altında müəyyən sürətlə nanopor kanal zülalından keçir.
Molekullar kimyəvi quruluşa görə müxtəlif elektrik siqnalları yaradır.
Rardıcıllıqların eal-time aşkarlanması əsas çağırışla əldə edilir.
Tam uzunluqlu transkriptom ardıcıllığının icrası
√ Data Saturation
Müqayisə edilə bilən məlumat doymasına çatmaq üçün 7 qat daha az oxunma tələb olunur.
√ Transkript Strukturunun İdentifikasiyası
Hər bir transkriptin tam uzunluqda konsensus oxunması ilə müxtəlif struktur variantlarının müəyyən edilməsi
√ Transkript səviyyəsində diferensial analiz -Qısa oxunuşlarla gizlədilmiş dəyişiklikləri aşkar edin
İstinad
Tang AD , Soulette CM , Baren MJV , et al.Xroniki lenfositik lösemidə SF3B1 mutasiyasının tam uzunluqlu transkript xarakteristikası saxlanılan intronların [J] aşağı tənzimlənməsini aşkar edir.Təbiət Əlaqələri.
Tech və Highlights müxtəlif tədqiqat arenalarında müxtəlif yüksək məhsuldarlıqlı ardıcıllıq texnologiyalarının ən son uğurlu tətbiqini, eləcə də eksperimental dizayn və məlumatların əldə edilməsində parlaq fikirləri bölüşmək məqsədi daşıyır.
Göndərmə vaxtı: 08 yanvar 2022-ci il