Поўнаметражнае секвенирование мРНК -PacBio
Перавагі абслугоўвання
● Прамое счытванне малекулы кДНК поўнай даўжыні ад 3'- канца да 5'- канца
● Разрозненне ўзроўню ізаформы ў структуры паслядоўнасці
● Стэнаграмы з высокай дакладнасцю і цэласнасцю
● Высокая сумяшчальнасць з рознымі відамі
● Вялікая ёмістасць секвенирования з 4 абсталяванымі платформамі секвенирования PacBio Sequel II
● Мае вялікі вопыт у больш чым 700 праектах секвенирования РНК на аснове Pacbio
● Дастаўка вынікаў на аснове BMKCloud: індывідуальны аналіз даных даступны на платформе.
● Пасляпродажнае абслугоўванне дзейнічае на працягу 3 месяцаў пасля завяршэння праекта
Спецыфікацыі абслугоўвання
Платформа: PacBio Sequel II
Бібліятэка секвенирования: бібліятэка мРНК, узбагачаная Poly A
Рэкамендаваны выхад даных: 20 Гб/выбар (у залежнасці ад выгляду)
FLNC（%）： ≥75%
*FLNC: поўнаметражныя нехімерныя транскрыпты
Біяінфарматычныя аналізы
● Апрацоўка неапрацаваных дадзеных
● Ідэнтыфікацыя стэнаграмы
● Структура паслядоўнасці
● Колькасная ацэнка выразаў
● Анатацыя функцыі
Узоры патрабаванняў і пастаўка
Узоры патрабаванняў:
Нуклеатыды:
| Канц. (нг/мкл) | Колькасць (мкг) | Чысціня | Сумленнасць |
| ≥ 120 | ≥ 0,6 | OD260/280=1,7-2,5 OD260/230=0,5-2,5 Забруджванне бялком або ДНК на гелі абмежавана або адсутнічае. | Для раслін: RIN≥7,5; Для жывёл: RIN≥8,0; 5,0≥ 28S/18S≥1,0; абмежаванае павышэнне зыходнага ўзроўню або яго адсутнасць |
Тканіна: Вага (сухі):≥1 г
*Для тканіны, меншай за 5 мг, мы рэкамендуем адправіць хутка замарожаны (у вадкім азоце) узор тканіны.
Клеткавая завісь:Колькасць клетак = 3×106- 1×107
*Мы рэкамендуем адпраўляць замарожаны лізат клетак.У выпадку, калі колькасць клетак менш 5×105, рэкамендуецца хуткая замарозка ў вадкім азоце, якая з'яўляецца пераважнай для мікраэкстракцыі.
Узоры крыві:Аб'ём≥1 мл
мікраарганізмы:Маса ≥ 1 г
Рэкамендаваны ўзор дастаўкі
Кантэйнер:
Цэнтрыфужная прабірка на 2 мл (не рэкамендуецца выкарыстоўваць алавяную фальгу)
Прыклад маркіроўкі: група+рэплікацыя, напрыклад, A1, A2, A3;B1, B2, B3... ...
Адгрузка:
1. Сухі лёд: Узоры трэба спакаваць у пакеты і закапаць у сухі лёд.
2. Прабіркі для стабілізацыі РНК: узоры РНК можна высушыць у прабірцы для стабілізацыі РНК (напрыклад, RNAstable®) і адправіць пры пакаёвай тэмпературы.
Працэдура абслугоўвання
Дызайн эксперыменту
Дастаўка ўзору
Вылучэнне РНК
Будаўніцтва бібліятэкі
Секвеніраванне
Аналіз дадзеных
Пасляпродажнае абслугоўванне
1.Размеркаванне па даўжыні FLNC
Даўжыня поўнаметражнага нехімернага чытання (FLNC) паказвае даўжыню кДНК у канструкцыі бібліятэкі.Размеркаванне FLNC па даўжыні з'яўляецца найважнейшым паказчыкам у ацэнцы якасці пабудовы бібліятэкі.
Размеркаванне даўжыні чытання FLNC
2. Поўнае размеркаванне даўжыні вобласці ORF
Мы выкарыстоўваем TransDecoder для прагназавання абласцей кадавання бялкоў і адпаведных амінакіслотных паслядоўнасцей для стварэння набораў unigene, якія змяшчаюць поўную нелішнюю інфармацыю аб стэнаграме ва ўсіх узорах.
Поўнае размеркаванне даўжыні вобласці ORF
3.Аналіз ўзбагачэння шляху KEGG
Транскрыпты з дыферэнцыяльнай экспрэсіяй (DET) могуць быць ідэнтыфікаваныя шляхам выраўноўвання даных секвенирования РНК на аснове NGS з наборамі поўнаметражных транскрыптаў, атрыманых з дапамогай даных секвенирования PacBio.Гэтыя DET могуць дадаткова апрацоўвацца для розных функцыянальных аналізаў, напрыклад аналізу ўзбагачэння шляху KEGG.
Узбагачэнне шляху DET KEGG - Кропкавы графік
Справа БМК
Дынаміка развіцця ствалавой транскриптомы Populus
Апублікавана: Часопіс біятэхналогіі раслін, 2019 год
Стратэгія паслядоўнасці:
Калекцыя ўзораў:вобласці сцябла: верхавіна, першае міжвузеллі (IN1), другое міжвузеллі (IN2), трэцяе міжвузеллі (IN3), міжвузеллі (IN4) і міжвузеллі (IN5) ад Nanlin895
NGS-паслядоўнасць:РНК 15 асобін былі аб'яднаны ў адзін біялагічны ўзор.Тры біялагічныя паўторы кожнай кропкі былі апрацаваны для паслядоўнасці NGS
TGS-паслядоўнасць:Вобласці сцябла былі падзелены на тры вобласці, г.зн. верхавіну, IN1-IN3 і IN4-IN5.Кожны рэгіён быў апрацаваны для секвенирования PacBio з чатырма тыпамі бібліятэк: 0-1 кб, 1-2 кб, 2-3 кб і 3-10 кб.
Асноўныя вынікі
1. Было ідэнтыфікавана 87150 поўнаметражных транскрыптаў, у якіх ідэнтыфікавана 2081 новая ізаформа і 62058 новых альтэрнатыўных сплайсаваных ізаформ.
Было ідэнтыфікавана 2,1187 lncRNA і 356 злітых генаў.
3. Ад першаснага росту да другаснага росту было ідэнтыфікавана 15838 дыферэнцыяльна экспрэсіраваных транскрыптаў з 995 дыферэнцыравана экспрэсаваных генаў.Ва ўсіх DEG 1216 былі фактарамі транскрыпцыі, пра большасць з якіх пакуль не паведамляецца.
Аналіз узбагачэння 4.GO выявіў важнасць дзялення клетак і акісляльна-аднаўленчага працэсу ў першасным і другасным росце.
Альтэрнатыўныя падзеі сплайсінгу і розныя ізаформы
WGCNA аналіз фактараў транскрыпцыі
Даведка
Chao Q, Gao ZF, Zhang D і інш.Дынаміка развіцця ствалавой транскриптомы Populus.Plant Biotechnol J. 2019;17(1):206-219.doi:10.1111/pbi.12958
