Аднаядзернае секвенаванне РНК
Тэхнічная схема
Ізаляцыя ядраў дасягаецца з дапамогай сістэмы 10× Genomics Chromium™, якая складаецца з васьміканальнай мікрафлюіднай сістэмы з падвойнымі скрыжаваннямі. У гэтай сістэме гелевыя шарыкі са штрых-кодамі і праймерам, ферменты і адно ядро інкапсулююцца ў кроплю алею памерам з наналітр, ствараючы гелевыя шарыкі ў эмульсіі (GEM). Пасля ўтварэння GEM у кожнай GEM адбываецца лізіс клетак і вызваленне штрых-кодаў. мРНК зваротна транскрыбуецца ў малекулы кДНК з 10× штрых-кодамі і UMI, якія далей падвяргаюцца стандартнаму секвенаванню.
Асаблівасці
● Падрыхтоўка суспензіі аднакадравых клетак з замарожаных тканін
● Утварэнне гелевых шарыкаў у эмульсіі (GEM) з наступным сінтэзам кДНК
● Кожная шарыка ў GEM загружана праймерамі, якія складаюцца з 4 секцый:
полі(dT) хвост для прайміравання мРНК і сінтэзу кДНК,
Унікальны малекулярны ідэнтыфікатар (UMI) для карэкцыі зрушэння ампліфікацыі
10-кратны штрых-код
Звязальная паслядоўнасць частковага чытання 1-га праймера для секвенавання
Перавагі
Аднаядзернае секвенаванне РНК абыходзіць абмежаванні аднаклетачнага секвенавання РНК, дазваляючы:
● Выкарыстанне замарожаных узораў, а не толькі свежых
● Нізкі стрэс замарожаных клетак у параўнанні з ферментатыўнай апрацоўкай свежых клетак, што адлюстроўваецца ў дадзеных транскрыпта ў выглядзе меншай колькасці генаў, выкліканых стрэсам
● Няма неабходнасці папярэдняга выдалення эрытрацытаў
● Неабмежаваны дыяметр ячэйкі
● Вялікі масіў узораў, прыдатных для аналізу, у тым ліку складаныя і далікатныя тыпы тканін, схільныя да зліпання або разбурэння клетак падчас дысацыяцыі тканін
Узоры, якія нельга прааналізаваць з дапамогай секвенавання РНК адной клеткі, але якія падыходзяць для секвенавання РНК адной ядра:
| Клетка / Тканіна | Прычына |
| Незамарожаная тканіна | Немагчыма атрымаць новыя або даўно захаваныя арганізацыі |
| Мышачная клетка, мегакарыяцыт, тлушчавая клетка… | Дыяметр ячэйкі занадта вялікі для ўваходу ў прыбор |
| Печань… | Занадта далікатныя, каб зламацца, не могуць адрозніць асобныя клеткі |
| Нейронная клетка, мозг… | Больш адчувальныя, лёгка паддаюцца стрэсу, зменяць вынікі секвенавання |
| Падстраўнікавая залоза, шчытападобная залоза… | Багаты на эндагенныя ферменты, якія ўплываюць на выпрацоўку суспензіі адзіночных клетак |
Аднаядзерны супраць аднаклетачнага
| Аднаядзерны | Аднаклетачны |
| Неабмежаваны дыяметр ячэйкі | Дыяметр ячэйкі: 10-40 мкм |
| Матэрыялам можа быць замарожаная тканіна | Матэрыял павінен быць свежай тканінай |
| Нізкі стрэс замарожаных клетак | Ферментная апрацоўка можа выклікаць рэакцыю клетак на стрэс |
| Не трэба выдаляць эрытрацыты | Трэба выдаліць эрытрацыты |
| Ядзерная энергія выражае біяінфармацыю | Уся клетка выказвае біяінфармацыю |
Тэхнічныя характарыстыкі
| Патрабаванні да ўзораў | Бібліятэка | Стратэгія секвенавання | Рэкамендаваныя дадзеныя | Кантроль якасці |
| Жывёльныя тканіны ≥ 200 мг Раслінная тканіна ≥ 400 мг | 10-кратная бібліятэка кДНК Genomics sn | Ілюміна PE150 | 100 тыс. чытанняў PE на ячэйку (100-200 Гб) | 700-1200 ядраў/мкл і цэласнасць ядраў, назіраная пад мікраскопам |
Каб атрымаць больш падрабязную інфармацыю аб рэкамендацыях па падрыхтоўцы ўзораў і працоўным працэсе абслугоўвання, звярніцеся даЭксперт BMKGENE
Працоўны працэс абслугоўвання
Уключае наступны аналіз:
● Кантроль якасці: колькасць клетак, выяўленне генаў, дакладная ідэнтыфікацыя клетак, малекул РНК і колькасная ацэнка экспрэсіі
● Унутраны аналіз узору:
Кластэрызацыя клетак і анатацыя кластараў
Дыферэнцыяльны экспрэсійны аналіз: ідэнтыфікацыя дыферэнцыяльных элементаў (DEG) у кластарах
Функцыянальная анатацыя і ўзбагачэнне кластарных DEG
● Міжгрупавы аналіз:
Камбінацыя дадзеных
Дыферэнцыяльны экспрэсійны аналіз: ідэнтыфікацыя DEG у групах
Функцыянальная анатацыя і ўзбагачэнне групавых DEG
● Пашыраны аналіз:
Аналіз клеткавага цыклу
Псеўдачасовы аналіз
Аналіз сотавай сувязі (CellPhoneDB)
Аналіз узбагачэння набору генаў (GSEA)
Аналіз унутранай выбаркі
Кластэрызацыя клетак:
Дыферэнцыяльны экспрэсійны аналіз: кластарныя DEG
Міжгрупавы аналіз
Дыферэнцыяльны экспрэсійны аналіз: групавыя DEG
Пашыраны аналіз:
Псеўдачасавы аналіз:
Аналіз клеткавага цыклу:
Даведайцеся пра дасягненні, якія дасягнулі дзякуючы паслугам BMKGene па секвенаванні аднаядзернай РНК з дапамогай 10X Chromium, у гэтых рэкамендаваных публікацыях:
Ван, Л. і інш. (2021) «Транскрыптомны аналіз аднаклетачных клетак раскрывае імунны ландшафт лёгкіх пры абвастрэнні астмы, рэзістэнтнай да стэроідаў».Працы Нацыянальнай акадэміі навук Злучаных Штатаў Амерыкі, 118(2), с. e2005590118. doi: 10.1073/pnas.2005590118
Чжэн, Х. і інш. (2022) «Глабальная рэгуляторная сетка для парушэнняў экспрэсіі генаў і анамальнай метабалічнай сігналізацыі ў імунных клетках у мікраасяроддзі хваробы Грэйвса і тырэаідыту Хашымота».Межы ў імуналогіі, 13, с. 879824. doi: 10.3389/FIMMU.2022.879824/BIBTEX.
Tian, H. і інш. (2023) «Аднаклетачны транскрыптом выяўляе гетэрагеннасць і імунныя рэакцыі лейкацытаў пасля вакцынацыі інактываванай Edwardsiella tarda ў камбалы (Paralichthys olivaceus)».Аквакультура, 566, с. 739238. doi: 10.1016/J.AQUACULTURE.2023.739238.
Ю, Ю. і інш. (2023) «Фотадынамічная тэрапія паляпшае вынікі інгібітараў імунных кантрольных кропак шляхам рэмадэлявання супрацьпухліннага імунітэту ў пацыентаў з ракам страўніка».Рак страўніка, 26(5), с. 798–813. doi: 10.1007/S10120-023-01409-X/МЕТРЫКІ.
