Секвениране на иРНК в пълна дължина -PacBio
Предимства на услугата
● Директно четене на пълна дължина на cDNA молекула от 3'- край до 5'- край
● Резолюция на нивото на изоформа в структурата на последователността
● Преписи с висока точност и почтеност
● Силно съвместим с различни видове
● Голям капацитет за секвениране с оборудвани 4 платформи за секвениране PacBio Sequel II
● Голям опит с над 700 проекта за секвениране на РНК, базирани на Pacbio
● Предоставяне на резултати, базирано на BMKCloud: Персонализирано извличане на данни, достъпно на платформата.
● Следпродажбено обслужване, валидно за 3 месеца след завършване на проекта
Сервизни спецификации
Платформа: PacBio Sequel II
Библиотека за секвениране: Поли А-обогатена иРНК библиотека
Препоръчителен капацитет на данните: 20 Gb/проба (в зависимост от вида)
FLNC（%）： ≥75%
*FLNC: Пълнометражни нехимерни транскрипти
Биоинформатични анализи
● Обработка на необработени данни
● Идентификация на препис
● Структура на последователността
● Количествено определяне на израза
● Анотация на функцията
Примерни изисквания и доставка
Примерни изисквания:
Нуклеотиди:
| Конц. (ng/μl) | Количество (μg) | Чистота | Интегритет |
| ≥ 120 | ≥ 0,6 | OD260/280=1,7-2,5 OD260/230=0,5-2,5 Ограничено или никакво протеиново или ДНК замърсяване, показано на гела. | За растения: RIN≥7.5; За животни: RIN≥8.0; 5.0≥ 28S/18S≥1.0; ограничено или никакво повишение на базовата линия |
Кърпа: Тегло (суха):≥1 g
*За тъкани, по-малки от 5 mg, препоръчваме да изпратите бързо замразена (в течен азот) тъканна проба.
Клетъчна суспензия:Брой клетки = 3×106- 1×107
*Препоръчваме да изпратите замразен клетъчен лизат.В случай, че тази клетка е по-малка от 5×105, препоръчва се бързо замразяване в течен азот, което е за предпочитане за микроекстракция.
Кръвни проби:Обем≥1 mL
Микроорганизъм:Маса ≥ 1 g
Препоръчителна доставка на мостри
Контейнер:
2 ml центрофужна епруветка (не се препоръчва калаено фолио)
Примерно етикетиране: Групиране+репликат напр. A1, A2, A3;B1, B2, B3... ...
Пратка:
1. Сух лед: Пробите трябва да бъдат опаковани в торби и заровени в сух лед.
2. РНК стабилни епруветки: РНК пробите могат да бъдат изсушени в РНК стабилизираща епруветка (напр. RNAstable®) и изпратени при стайна температура.
Работен поток на услугата
Дизайн на експеримента
Доставка на мостри
Екстракция на РНК
Изграждане на библиотека
Секвениране
Анализ на данни
Следпродажбени услуги
1.Разпределение на дължината на FLNC
Дължината на нехимерно четене с пълна дължина (FLNC) показва дължината на cDNA в конструкцията на библиотеката.Разпределението на дължината на FLNC е решаващ индикатор при оценката на качеството на конструкцията на библиотеката.
Разпределение на дължината на четене на FLNC
2. Пълно разпределение на дължината на региона на ORF
Ние използваме TransDecoder за предсказване на протеинови кодиращи региони и съответните аминокиселинни последователности за генериране на унигенни комплекти, които съдържат пълна неизлишна информация за транскрипт във всички проби.
Пълно разпределение на дължината на региона на ORF
3. Анализ на обогатяване на пътя на KEGG
Диференциално експресираните транскрипти (DETs) могат да бъдат идентифицирани чрез подравняване на NGS-базирани данни за секвениране на РНК върху комплекти транскрипти с пълна дължина, генерирани от данни за секвениране на PacBio.Тези DET могат допълнително да се обработват за различни функционални анализи, например анализ на обогатяване на пътя на KEGG.
Обогатяване на пътя на DET KEGG - Точков график
Калъф BMK
Динамиката на развитие на транскриптома на стъблото на Populus
Публикувано: Вестник за растителна биотехнология, 2019 г
Стратегия за последователност:
Колекция от проби:области на стъблото: връх, първо междувъзлие (IN1), второ междувъзлие (IN2), трето междувъзлие (IN3), междувъзлие (IN4) и междувъзлие (IN5) от Nanlin895
NGS-последователност:РНК от 15 индивида бяха събрани като една биологична проба.Три биологични реплики на всяка точка бяха обработени за NGS последователност
TGS-последователност:Областите на стъблото бяха разделени на три области, т.е. апекс, IN1-IN3 и IN4-IN5.Всеки регион беше обработен за PacBio секвениране с четири типа библиотеки: 0-1 kb, 1-2 kb, 2-3 kb и 3-10 kb.
Ключови резултати
1. Бяха идентифицирани общо 87150 транскрипта с пълна дължина, в които бяха идентифицирани 2081 нови изоформи и 62058 нови алтернативни сплайсирани изоформи.
Идентифицирани са 2.1187 lncRNA и 356 слети гена.
3. От първичен растеж до вторичен растеж бяха идентифицирани 15838 диференциално експресирани транскрипта от 995 диференциално експресирани гени.Във всички DEG 1216 са били транскрипционни фактори, повечето от които все още не са докладвани.
Анализът на обогатяване на 4.GO разкри значението на клетъчното делене и процеса на окисление-редукция в първичния и вторичния растеж.
Алтернативни събития на снаждане и различни изоформи
WGCNA анализ на транскрипционните фактори
справка
Chao Q, Gao ZF, Zhang D и др.Динамиката на развитие на транскриптома на стъблото на Populus.Plant Biotechnol J. 2019; 17 (1): 206-219.doi:10.1111/pbi.12958
