Dugo nekodirajuće sekvenciranje-Illumina
Prednosti usluge
● Prednosti usluge
● Specifične ćelije i tkiva
● Specifična faza izražava i predstavlja dinamičku promjenu izraza
● Precizni obrasci izražavanja vremena i prostora
● Zajednička analiza sa podacima o mRNA.
● Isporuka rezultata zasnovana na BMKCloud-u: Prilagođeno rudarenje podataka dostupno na platformi.
● Usluge nakon prodaje vrijede 3 mjeseca po završetku projekta
Zahtjevi za uzorke i dostava
| Biblioteka | Platforma | Preporučeni podaci | Podaci QC |
| rRNA iscrpljivanje | Illumina PE150 | 10 Gb | Q30≥85% |
| Konc. (ng/μl) | Količina (μg) | Čistoća | Integritet |
| ≥ 100 | ≥ 0,5 | OD260/280=1,7-2,5 OD260/230=0,5-2,5 Ograničena ili nikakva kontaminacija proteina ili DNK prikazana na gelu. | Za biljke: RIN≥6,5; Za životinje: RIN≥7,0; 5.0≥28S/18S≥1.0; ograničeno ili nikakvo podizanje osnovne linije |
nukleotidi:
Markivo: Težina (suvo): ≥1 g
*Za tkivo manje od 5 mg, preporučujemo da pošaljete fleš zamrznut (u tečnom azotu) uzorak tkiva.
Suspenzija ćelija: Broj ćelija = 3×107
*Preporučujemo slanje zamrznutog ćelijskog lizata.U slučaju da ta ćelija broji manji od 5×105, preporučuje se brzo zamrzavanje u tečnom azotu.
Uzorci krvi:
PA×geneBloodRNATube;
6mLTRIzola i 2mL krvi (TRIzol:Krv=3:1)
Preporučena dostava uzorka
Spremnik: epruveta za centrifugiranje od 2 ml (ne preporučuje se limena folija)
Označavanje uzorka: Grupa+replikacija npr. A1, A2, A3;B1, B2, B3... ...
pošiljka:
1. Suhi led: Uzorci se moraju spakovati u vreće i zakopati u suvi led.
2. RNK stabilne epruvete: Uzorci RNK se mogu osušiti u RNA stabilizacijskoj epruveti (npr. RNAstable®) i poslati na sobnoj temperaturi.
Tok rada usluge
Dizajn eksperimenta
Isporuka uzorka
Ekstrakcija RNK
Izgradnja biblioteke
Sekvenciranje
Analiza podataka
Usluge nakon prodaje
Bioinformatika
1.LncRNA klasifikacija
LncRNA predviđena pomoću četiri gornja softvera klasifikovana je u 4 kategorije: lincRNA, anti-sense-LncRNA, intronic-LncRNA;smisao-LncRNA.Klasifikacija LncRNA je prikazana na histogramu ispod.
LncRNA klasifikacija
2.Cis-ciljani geni analize obogaćivanja DE-lncRNA
ClusterProfiler je korišćen u analizi GO obogaćivanja na cis-ciljanim genima različito eksprimirane lncRNA (DE-lncRNA), u smislu bioloških procesa, molekularnih funkcija i ćelijskih komponenti.Analiza obogaćivanja GO je proces za identifikaciju značajno obogaćenih GO termina usmjerenih na DEG u poređenju sa cijelim genomom.Obogaćeni pojmovi su predstavljeni u histogramu, balon grafikonu, itd. kao što je prikazano ispod.
Cis-ciljani geni analize obogaćivanja DE-lncRNA - Bubble chart
3. Upoređujući dužinu, broj egzona, ORF i količinu ekspresije mRNA i lncRNA, možemo razumjeti razlike u strukturi, sekvenci i tako dalje između njih, te također provjeriti da li je nova lncRNA koju smo predvidjeli u skladu sa općim karakteristikama.
BMK Case
Deregulirani profil ekspresije lncRNA u adenokarcinomima pluća miša s mutacijom KRAS-G12D i nokautom P53
Objavljeno:Časopis za ćelijsku i molekularnu medicinu,2019
Strategija sekvenciranja
Illumina
Sakupljanje uzoraka
NONMMUT015812-knockdown KP (shRNA-2) ćelije i negativne kontrole (sh-Scr) ćelije su dobijene 6. dana specifične virusne infekcije.
Ključni rezultati
Ova studija istražuje aberantno eksprimirane lncRNA u adenokarcinomu pluća miša s nokautom P53 i mutacijom KrasG12D.
1,6424 lncRNA je različito izraženo (≥ 2-struka promjena, P < 0,05).
2. Među svih 210 lncRNA (FC≥8), ekspresija 11 lncRNA je regulisana P53, 33 lncRNA pomoću KRAS i 13 lncRNA hipoksijom u primarnim KP ćelijama, respektivno.
3.NONMMUT015812, koji je bio značajno pojačan u adenokarcinomu pluća miša i negativno reguliran ponovnom ekspresijom P53, otkriven je radi analize njegove ćelijske funkcije.
4. Obaranje NONMMUT015812 od strane shRNA smanjilo je sposobnost proliferacije i migracije KP ćelija.NONMMUT015812 je bio potencijalni onkogen.
 Analiza KEGG puta diferencijalno eksprimiranih gena u NONMMUT015812-knockdown KP ćelijama |  Ontološka analiza gena diferencijalno eksprimiranih gena u NONMMUT015812-knockdown KP ćelijama |
Referenca
Deregulirani profil ekspresije lncRNA u adenokarcinomima pluća miša sa mutacijom KRAS-G12D i nokautom P53[J].Journal of Cellular and Molecular Medicine, 2019, 23(10).DOI: 10.1111/jcmm.14584
