Seqüenciació d'ARNm de longitud completa -PacBio
Avantatges del servei
● Lectura directa de la molècula d'ADNc de longitud completa des de l'extrem 3' fins a l'extrem 5'
● Resolució de nivell isoforma en l'estructura de seqüències
● Transcripcions amb gran precisió i integritat
● Altament compatible amb diverses espècies
● Gran capacitat de seqüenciació amb 4 plataformes de seqüenciació PacBio Sequel II equipades
● Molta experiència amb més de 700 projectes de seqüenciació d'ARN basats en Pacbio
● Lliurament de resultats basat en BMKCloud: extracció de dades personalitzada disponible a la plataforma.
● Serveis postvenda vàlids durant 3 mesos un cop finalitzat el projecte
Especificacions del servei
Plataforma: PacBio Sequel II
Biblioteca de seqüenciació: biblioteca d'ARNm enriquida amb Poly A
Rendiment de dades recomanat: 20 Gb/mostra (Depenent de l'espècie)
FLNC（%）： ≥75%
*FLNC: transcipts no quimèrics de llarga durada
Anàlisis bioinformàtics
● Tractament de dades en brut
● Identificació de la transcripció
● Estructura de la seqüència
● Quantificació de l'expressió
● Anotació de funcions
Requisits de mostra i lliurament
Requisits de mostra:
Nucleòtids:
| Conc. (ng/μl) | Quantitat (μg) | Puresa | Integritat |
| ≥ 120 | ≥ 0,6 | OD260/280=1,7-2,5 OD260/230=0,5-2,5 Es mostra al gel una contaminació limitada o nul·la de proteïnes o ADN. | Per a plantes: RIN≥7,5; Per a animals: RIN≥8,0; 5.0≥ 28S/18S≥1.0; elevació de referència limitada o nul·la |
Teixit: pes (sec):≥1 g
* Per a teixits de menys de 5 mg, recomanem enviar una mostra de teixit congelada (en nitrogen líquid).
Suspensió cel·lular:Recompte de cel·les = 3×106- 1×107
* Recomanem enviar lisat cel·lular congelat.En cas que aquesta cel·la tingui un nombre inferior a 5×105, es recomana congelar flash en nitrogen líquid, que és preferible per a la microextracció.
Mostres de sang:Volum ≥1 ml
Microorganisme:Massa ≥ 1 g
Lliurament de mostres recomanat
Contenidor:
Tub de centrífuga de 2 ml (no es recomana paper d'alumini)
Etiquetatge de la mostra: grup+rèplica, p. ex. A1, A2, A3;B1, B2, B3....
Enviament:
1. Gel sec: les mostres s'han d'envasar en bosses i enterrar-les en gel sec.
2. Tubs RNAstable: les mostres d'ARN es poden assecar en un tub d'estabilització d'ARN (per exemple, RNAstable®) i enviar-se a temperatura ambient.
Flux de treball del servei
Disseny d'experiments
Lliurament de la mostra
Extracció d'ARN
Construcció de la biblioteca
Seqüenciació
Anàlisi de dades
Serveis postvenda
1.Distribució de longituds FLNC
La longitud de la lectura no quimèrica de longitud completa (FLNC) indica la longitud de l'ADNc en la construcció de la biblioteca.La distribució de longituds FLNC és un indicador crucial per avaluar la qualitat de la construcció de biblioteques.
Distribució de longitud de lectura FLNC
2. Distribució completa de la longitud de la regió ORF
Utilitzem TransDecoder per predir les regions de codificació de proteïnes i les seqüències d'aminoàcids corresponents per generar conjunts unigènes, que conté informació completa de transcripció no redundant en totes les mostres.
Distribució completa de la longitud de la regió ORF
3.Anàlisi d'enriquiment de la via KEGG
Les transcripcions expressades de manera diferent (DET) es poden identificar alineant les dades de seqüenciació d'ARN basades en NGS en conjunts de transcripcions de longitud completa generats per les dades de seqüenciació de PacBio.Aquests DET es poden processar posteriorment per a diverses anàlisis funcionals, per exemple, l'anàlisi d'enriquiment de la via KEGG.
Enriquiment de la via DET KEGG -Gràfic de punts
Cas BMK
La dinàmica de desenvolupament del transcriptoma de la tija de Populus
Publicat: Revista de Biotecnologia Vegetal, 2019
Estratègia de seqüenciació:
Recollida de mostres:regions de la tija: àpex, primer entrenus (IN1), segon entrenus (IN2), tercer entrenus (IN3), entrenus (IN4) i entrenus (IN5) de Nanlin895
Seqüència NGS:L'ARN de 15 individus es va agrupar com una mostra biològica.Es van processar tres rèpliques biològiques de cada punt per a la seqüència NGS
Seqüència TGS:Les regions de la tija es van dividir en tres regions, és a dir, àpex, IN1-IN3 i IN4-IN5.Cada regió es va processar per a la seqüenciació PacBio amb quatre tipus de biblioteques: 0-1 kb, 1-2 kb, 2-3 kb i 3-10 kb.
Resultats clau
1.Es van identificar un total de 87150 transcripcions de llarga durada, en les quals es van identificar 2081 isoformes noves i 62058 isoformes spliced alternatives noves.
Es van identificar 2.1187 lncRNA i 356 gens de fusió.
3.Des del creixement primari fins al creixement secundari, es van identificar 15838 transcripcions expressades de manera diferencial de 995 gens expressats de manera diferencial.A tots els DEG, 1216 eren factors de transcripció, la majoria dels quals encara no s'han informat.
L'anàlisi d'enriquiment 4.GO va revelar la importància de la divisió cel·lular i el procés d'oxidació-reducció en el creixement primari i secundari.
Esdeveniments d'empalmament alternatius i diferents isoformes
Anàlisi WGCNA sobre factors de transcripció
Referència
Chao Q, Gao ZF, Zhang D, et al.La dinàmica de desenvolupament del transcriptoma de la tija de Populus.Plant Biotechnol J. 2019;17(1):206-219.doi:10.1111/pbi.12958
