Seqüenciació d'ARNm de longitud completa-Nanopore
Avantatges del servei
● Baix biaix de seqüència
● Revelació de molècules d'ADNc de longitud completa
● Menys dades necessàries per cobrir el mateix nombre de transcripcions
● Identificació de múltiples isoformes per gen
● Quantificació de l'expressió a nivell d'isoformes
Especificacions del servei
| Biblioteca | Plataforma | Rendiment de dades recomanat (Gb) | Control de qualitat |
| cDNA-PCR (enriquit amb Poly-A) | Nanopore PromethION P48 | 6 Gb/mostra (segons l'espècie) | Relació de longitud completa> 70% Puntuació de qualitat mitjana: Q10
|
Anàlisis bioinformàtics
●Tractament de dades en brut
● Identificació de la transcripció
● Empalmament alternatiu
● Quantificació de l'expressió a nivell de gens i isoformes
● Anàlisi d'expressió diferencial
● Annotació i enriquiment de funcions (DEG i DET)
Requisits de mostra i lliurament
Requisits de mostra:
Nucleòtids:
| Conc. (ng/μl) | Quantitat (μg) | Puresa | Integritat |
| ≥ 100 | ≥ 0,6 | OD260/280=1,7-2,5 OD260/230=0,5-2,5 Es mostra al gel una contaminació limitada o nul·la de proteïnes o ADN. | Per a plantes: RIN≥7,0; Per a animals: RIN≥7,5; 5,0≥28S/18S≥1,0; elevació de referència limitada o nul·la |
Teixit: Pes (sec): ≥1 g
* Per a teixits de menys de 5 mg, recomanem enviar una mostra de teixit congelada (en nitrogen líquid).
Suspensió cel·lular: Recompte de cèl·lules = 3×106- 1×107
* Recomanem enviar lisat cel·lular congelat.En cas que aquesta cel·la tingui un nombre inferior a 5×105, es recomana congelar flash en nitrogen líquid, que és preferible per a la microextracció.
Mostres de sang: Volum≥1 ml
Lliurament de mostres recomanat
Envàs: tub de centrífuga de 2 ml (no es recomana paper d'alumini)
Etiquetatge de la mostra: grup+rèplica, p. ex. A1, A2, A3;B1, B2, B3....
Enviament: 2, gel sec: les mostres s'han d'envasar en bosses i enterrar-se en gel sec.
- Tubs RNAstable: les mostres d'ARN es poden assecar al tub d'estabilització d'ARN (per exemple, RNAstable®) i enviar-se a temperatura ambient.
Flux de treball del servei
Nucleòtids:
Lliurament de la mostra
Construcció de la biblioteca
Seqüenciació
Anàlisi de dades
Serveis postvenda
Flux de treball del servei
teixit:
Disseny d'experiments
Lliurament de la mostra
Extracció d'ARN
Construcció de la biblioteca
Seqüenciació
Anàlisi de dades
Serveis postvenda
1.Anàlisi de l'expressió diferencial - Trama del volcà
L'anàlisi de l'expressió diferencial es pot processar tant a nivell de gens per identificar gens expressats de manera diferencial (DEG) com a nivell d'isoformes per identificar de manera diferencial.
transcripcions expressades (DET)
2.Mapa de calor de agrupació jeràrquica
3. Identificació i classificació de l'empalmament alternatiu
Astalavista pot predir cinc tipus d'esdeveniments d'empalmament alternatius.
4.Identificació d'esdeveniments de poliadenilació alternativa (APA) i motiu a 50 bp aigües amunt de poli-A
Cas BMK
Identificació d'empalmament alternatiu i quantificació a nivell d'isoformes mitjançant la seqüenciació de transcriptoma de longitud completa de nanopors
Publicat:Nature Communications, 2020
Estratègia de seqüenciació:
Agrupació: 1. CLL-SF3B1(WT);2. CLL-SF3B1 (mutació K700E);3. Cèl·lules B normals
Estratègia de seqüenciació: seqüenciació de la biblioteca MinION 2D, seqüenciació de la biblioteca PromethION 1D;dades de lectura curta de les mateixes mostres
Plataforma de seqüenciació: Nanopore MinION;Nanopore PromethION;
Resultats clau
1. Identificació d'empalmament alternatiu a nivell d'isoforma
Les seqüències de lectura llarga permeten la identificació del mutant SF3B1K700E- llocs d'empalmament alterats a nivell d'isoforma.Es va trobar que 35 alternatives 3′SS i 10 alternatives 5′SS es van empalmar de manera significativament diferencial entre SF3B1K700Ei SF3B1WT.33 de les 35 alteracions van ser descobertes recentment per seqüències de lectura llarga.
2.Quantificació de l'empalmament alternatiu a nivell isoforme
Expressió de les isoformes de retenció d'introns (IR) en SF3B1K700Ei SF3B1WTes van quantificar a partir de seqüències de nanopors, revelant una regulació global a la baixa de les isoformes IR a SF3B1K700E.
Referència
Tang AD , Soulette CM , Baren MJV , et al.La caracterització de la transcripció completa de la mutació SF3B1 en la leucèmia limfocítica crònica revela la baixada dels introns retinguts [J].Comunicacions de la natura.
