Full-length mRNA sequencing -PacBio
Mga Bentaha sa Serbisyo
● Direktang pagbasa sa tibuok nga molekula sa cDNA gikan sa 3'- katapusan ngadto sa 5'- katapusan
● Iso-form level resolution sa sequence structure
● Mga transcript nga adunay taas nga katukma ug integridad
● Nahiangay kaayo sa mga klase sa vaiours
● Dako nga sequencing capacity nga adunay 4 PacBio Sequel II sequencing platforms nasangkapan
● Labing eksperyensiyado sa kapin sa 700 ka mga proyekto sa pagsunud-sunod sa RNA nga nakabase sa Pacbio
● Paghatud sa resulta nga gibase sa BMKCloud: Ang customized data-mining anaa sa plataporma.
● After-sale nga mga serbisyo balido sulod sa 3 ka bulan human sa proyekto
Mga Detalye sa Serbisyo
Plataporma: PacBio Sequel II
Pagsunod-sunod nga librarya: Poly A- enriched mRNA library
Girekomendar nga abot sa datos: 20 Gb/sample (Depende sa espisye)
FLNC（%）： ≥75%
*FLNC: Full-length non-chimeric transcipts
Pag-analisar sa bioinformatics
● Hilaw nga pagproseso sa datos
● Transcript identification
● Pagkasunod-sunod nga istruktura
● Pagsukod sa Pagpahayag
● Function Annotation
Sample nga Kinahanglanon ug Paghatud
Sample nga Kinahanglanon:
Nucleotides:
| Conc.(ng/μl) | Gidaghanon (μg) | Kaputli | Integridad |
| ≥ 120 | ≥ 0.6 | OD260/280=1.7-2.5 OD260/230=0.5-2.5 Limitado o walay kontaminasyon sa protina o DNA nga gipakita sa gel. | Para sa mga tanom: RIN≥7.5; Para sa mga mananap: RIN≥8.0; 5.0≥ 28S/18S≥1.0; limitado o walay baseline elevation |
Tissue: Timbang(uga):≥1 g
*Para sa tissue nga mas gamay sa 5 mg, among girekomenda nga magpadala ug flash frozen(sa liquid nitrogen) tissue sample.
Cell suspension:Ihap sa selula = 3×106- 1×107
* Girekomenda namon nga ipadala ang frozen cell lysate.Sa kaso nga ang cell nag-ihap nga mas gamay sa 5 × 105, girekomendar ang flash frozen sa liquid nitrogen, nga mas maayo alang sa micro extraction.
Mga sample sa dugo:Volume≥1 mL
Microorganism:Misa ≥ 1 g
Girekomenda nga Sample Delivery
sudlanan:
2 ml centrifuge tube (Tin foil dili girekomendar)
Sample nga pag-label: Grupo+kopya eg A1, A2, A3;B1, B2, B3...
pagpadala:
1. Dry-ice: Ang mga sample kinahanglang ibutang sa mga bag ug ilubong sa dry-ice.
2. RNAstable tubes: Ang mga sample sa RNA mahimong mamala sa RNA stabilization tube(eg RNAstable®) ug ipadala sa temperatura sa lawak.
Daloy sa Trabaho sa Serbisyo
Eksperimento nga disenyo
Sample nga paghatod
Pagkuha sa RNA
Pagtukod sa librarya
Pagsunodsunod
Pagtuki sa datos
After-sale nga serbisyo
1.FLNC gitas-on-apod-apod
Ang gitas-on sa full-length nga non-chimeric read(FLNC) nagpaila sa gitas-on sa cDNA sa pagtukod sa library.Ang pag-apod-apod sa gitas-on sa FLNC usa ka hinungdanon nga timailhan sa pagtimbang-timbang sa kalidad sa pagtukod sa librarya.
Pag-apod-apod sa gitas-on sa pagbasa sa FLNC
2.Kompleto nga pag-apod-apod sa gitas-on sa rehiyon sa ORF
Gigamit namon ang TransDecoder aron matagna ang mga rehiyon sa pag-coding sa protina ug katugbang nga mga han-ay sa amino acid aron makamugna ang mga unigene set, nga adunay kompleto nga dili sobra nga kasayuran sa transcript sa tanan nga mga sample.
Kompletoha ang pag-apod-apod sa gitas-on sa rehiyon sa ORF
3.KEGG pathway enrichment analysis
Ang mga differentially expressed transcripts(DETs) mahimong mailhan pinaagi sa pag-align sa NGS-based RNA sequencing data sa full-length transcript sets nga gihimo sa PacBio sequencing data.Kini nga mga DET mahimong maproseso pa para sa lain-laing functional analysis, eg KEGG pathway enrichment analysis.
DET KEGG pathway enrichment -Dot plot
Kaso sa BMK
Ang dinamikong pag-uswag sa Populus stem transcriptome
Gipatik: Plant Biotechnology Journal, 2019
Estratehiya sa pagkasunodsunod:
Sample nga koleksyon:mga rehiyon sa tukog: apex, una nga internode (IN1), ikaduha nga internode (IN2), ikatulo nga internode (IN3), internode (IN4) ug internode (IN5) gikan sa Nanlin895
NGS-sunod-sunod:Ang RNA sa 15 ka mga indibidwal gitipon isip usa ka biological sample.Tulo ka biolohikal nga pagkopya sa matag punto ang giproseso alang sa han-ay sa NGS
TGS-sunod-sunod:Ang mga rehiyon sa stem gibahin sa tulo ka rehiyon, ie apex, IN1-IN3 ug IN4-IN5.Ang matag rehiyon giproseso para sa PacBio sequencing nga adunay upat ka klase sa library: 0-1 kb, 1-2 kb, 2-3 kb ug 3-10 kb.
Pangunang mga resulta
1. Usa ka kinatibuk-an nga 87150 ka bug-os nga gitas-on nga mga transkrip ang nahibal-an, diin, 2081 nga nobela isoform ug 62058 nga nobela nga alternatibo nga spliced isoform ang giila.
2.1187 lncRNA ug 356 fusion genes giila.
3.Gikan sa panguna nga pagtubo hangtod sa sekondaryang pagtubo, ang 15838 nga lahi nga gipahayag nga mga transkrip gikan sa 995 nga lahi nga gipahayag nga mga gene giila.Sa tanan nga mga DEG, 1216 ang mga hinungdan sa transkripsyon, kadaghanan niini wala pa gitaho.
Ang 4.GO enrichment analysis nagpadayag sa importansya sa cell division ug oxidation-reduction process sa primary ug secondary growth.
Alternatibong splicing nga mga panghitabo ug lain-laing mga isoform
Pag-analisar sa WGCNA sa mga hinungdan sa transkripsyon
Reperensya
Chao Q, Gao ZF, Zhang D, ug uban pa.Ang dinamikong pag-uswag sa Populus stem transcriptome.Plant Biotechnol J. 2019;17(1):206-219.doi:10.1111/pbi.12958
