Sekvenování mRNA v plné délce - PacBio
Funkce
● syntéza cDNA z poly-A mRNA s následnou přípravou knihovny
● Sekvenování v režimu CCS, generování HiFi čtení
● Sekvencování transkriptů v plné délce
● Analýza nevyžaduje referenční genom; nicméně může být použita
● Bioinformatická analýza umožňuje analýzu transkriptů izoform lncRNA, genových fúzí, polyadenylace a genové struktury
Výhody služby
●Vysoká přesnostHiFi čte s přesností >99,9 % (Q30), srovnatelnou s NGS
● Analýza alternativního sestřihuSekvenování celých transkriptů umožňuje identifikaci a charakterizaci izoforem
●Rozsáhlé odborné znalostiS výsledky v oblasti dokončení více než 1100 projektů transkriptomu v plné délce v rámci PacBio a zpracováním více než 2300 vzorků přináší náš tým do každého projektu bohaté zkušenosti.
●Poprodejní podporaNáš závazek sahá i nad rámec dokončení projektu a zahrnuje 3měsíční poprodejní servis. Během této doby nabízíme následnou podporu projektu, pomoc s řešením problémů a diskuze s otázkami a odpověďmi, kde zodpovíme veškeré dotazy týkající se výsledků.
Požadavky na vzorky a dodání
| Knihovna | Strategie sekvenování | Doporučená data | Kontrola kvality |
| Knihovna CCS mRNA obohacená o polyA | PacBio Pokračování II PacBio Revio | 20/40 GB 5/10 milionů CCS | Q30≥85% |
Požadavky na vzorek:
Nukleotidy:
● Rostliny:
Kořen, stonek nebo okvětní lístek: 450 mg
List nebo semeno: 300 mg
Ovoce: 1,2 g
● Zvíře:
Srdce nebo střeva: 300 mg
Vnitřnosti nebo mozek: 240 mg
Sval: 450 mg
Kosti, vlasy nebo kůže: 1 g
● Členovci:
Hmyz: 6 g
Korýši: 300 mg
● Plná krev1 tuba
● Buňky: 106 buňky
| Konc. (ng/μl) | Množství (μg) | Čistota | Integrita |
| ≥ 100 | ≥ 1,0 | OD260/280=1,7-2,5 OD260/230=0,5-2,5 Na gelu je patrná omezená nebo žádná kontaminace proteiny nebo DNA. | Pro rostliny: RIN ≥ 7,5; Pro zvířata: RIN ≥ 8,0; 5,0 ≥ 28S/18S ≥ 1,0; omezená nebo žádná elevace základní linie |
Doporučené dodání vzorku
Kontejner: 2ml centrifugační zkumavka (nedoporučuje se cínová fólie)
Ukázkové označení: Seskupit + replikovat, např. A1, A2, A3; B1, B2, B3.
Zásilka:
1. Suchý led: Vzorky je třeba zabalit do pytlů a uložit do suchého ledu.
2. Zkumavky pro stabilizaci RNA: Vzorky RNA lze sušit ve zkumavce pro stabilizaci RNA (např. RNAstable®) a přepravovat při pokojové teplotě.
Pracovní postup služby
Návrh experimentu
Dodání vzorku
Extrakce RNA
Výstavba knihovny
Sekvenování
Analýza dat
Poprodejní služby
Zahrnuje následující analýzu:
● Kontrola kvality nezpracovaných dat
● Alternativní polyadenylační analýza (APA)
● Analýza fúzních transkriptů
● Analýza alternativního sestřihu
● Srovnávací analýza univerzálních jednokopiových orthologů (BUSCO)
● Analýza nových transkriptů: predikce kódujících sekvencí (CDS) a funkční anotace
● Analýza lncRNA: predikce lncRNA a cílů
● Identifikace mikrosatelitů (SSR)
Analýza BUSCO
Analýza alternativního sestřihu
Alternativní polyadenylační analýza (APA)
Funkční anotace nových transkriptů
V této publikaci se podívejte na pokroky, které umožnily služby sekvenování mRNA v plné délce Nanopore od společnosti BMKGene.
Ma, Y. a kol. (2023) „Srovnávací analýza metod sekvenování RNA PacBio a ONT pro identifikaci jedu Nemopilema Nomurai“, Genomics, 115(6), s. 110709. doi: 10.1016/J.YGENO.2023.110709.
Chao, Q. a kol. (2019) „Vývojová dynamika transkriptomu stonku Populus“, Plant Biotechnology Journal, 17(1), s. 206–219. doi: 10.1111/PBI.12958.
Deng, H. a kol. (2022) „Dynamické změny obsahu kyseliny askorbové během vývoje a zrání plodů Actinidia latifolia (plodiny bohaté na askorbát) a související molekulární mechanismy“, International Journal of Molecular Sciences, 23(10), s. 5808. doi: 10.3390/IJMS23105808/S1.
Hua, X. a kol. (2022) „Efektivní predikce genů biosyntetických drah zapojených do bioaktivních polyfylinů u Paris Polyphylla“, Communications Biology 2022 5:1, 5(1), s. 1–10. doi: 10.1038/s42003-022-03000-z.
Liu, M. a kol. (2023) „Kombinovaná analýza PacBio Iso-Seq a Illumina RNA-Seq transkriptomu a genů cytochromu P450 Tuta absoluta (Meyrick)“, Insects, 14(4), s. 363. doi: 10.3390/INSECTS14040363/S1.
Wang, Lijun a kol. (2019) „Průzkum komplexnosti transkriptomu s využitím analýzy jednotlivých molekul v reálném čase pomocí PacBio v kombinaci se sekvenováním RNA pomocí Illumina pro lepší pochopení biosyntézy kyseliny ricinolejové u Ricinus communis“, BMC Genomics, 20(1), s. 1–17. doi: 10.1186/S12864-019-5832-9.
