produkty

Sekvenování mRNA plné délky - PacBio

De novosekvenování transkriptomu v plné délce, známé také jakoDe novoIso-Seq využívá výhody sekvenátoru PacBio v délce čtení, která umožňuje sekvenování molekul cDNA v plné délce bez jakýchkoli přerušení.Tím se zcela zabrání jakýmkoli chybám generovaným v krocích sestavování přepisu a konstruuje se unigenní sady s rozlišením na úrovni izoforem.Tyto unigenové sady poskytují výkonnou genetickou informaci jako „referenční genom“ na úrovni transkriptomu.Kromě toho tato služba v kombinaci se sekvenačními daty nové generace umožňuje přesnou kvantifikaci exprese na úrovni izoforem.

Platforma: PacBio Sequel II

Knihovna: SMRT zvonková knihovna

Kontaktujte nás

Podrobnosti o službě

Výsledky ukázky

Případová studie

Výhody služby

● Přímé čtení molekuly cDNA plné délky od 3'- konce k 5'- konci

● Rozlišení na úrovni isoformy ve struktuře sekvence

● Přepisy s vysokou přesností a integritou

● Vysoce kompatibilní s různými druhy

● Velká sekvenační kapacita se 4 vybavenými sekvenačními platformami PacBio Sequel II

● Zkušenosti s více než 700 projekty sekvenování RNA na bázi Pacbio

● Doručování výsledků na bázi BMKCloud: Na platformě je k dispozici přizpůsobené dolování dat.

● Poprodejní služby platné 3 měsíce po dokončení projektu

Specifikace služby

Platforma: PacBio Sequel II

Sekvenační knihovna: mRNA knihovna obohacená o Poly A

Doporučený datový výtěžek: 20 Gb/vzorek (v závislosti na druhu)

FLNC（%））: ≥75 %

*FLNC: Nechimérické transcipty plné délky

Bioinformatické analýzy

● Zpracování nezpracovaných dat

● Identifikace přepisu

● Struktura sekvence

● Kvantifikace výrazů

● Anotace funkce

Vzorové požadavky a dodání

Vzorové požadavky:

Nukleotidy:

Konc. (ng/μl)

množství (μg)

Čistota

Integrita

≥ 120

≥ 0,6

OD260/280 = 1,7-2,5

OD260/230=0,5-2,5

Omezená nebo žádná kontaminace proteiny nebo DNA na gelu.

Pro rostliny: RIN≥7,5;

Pro zvířata: RIN≥8,0;

5,0≥ 28S/18S≥1,0;

omezená nebo žádná základní elevace

Tkáň: Hmotnost (suchá):≥1 g
*Pro tkáň menší než 5 mg doporučujeme odeslat bleskově zmrazený (v tekutém dusíku) vzorek tkáně.

Buněčná suspenze:Počet buněk = 3×10⁶- 1×10⁷
*Doporučujeme zasílat zmrazený buněčný lyzát.V případě, že počet buněk je menší než 5×10⁵, doporučuje se bleskově zmrazit v tekutém dusíku, což je vhodnější pro mikroextrakce.

Vzorky krve:Objem ≥1 ml

Mikroorganismus:Hmotnost ≥ 1 g

Doporučené doručení vzorku

Kontejner:
2 ml centrifugační zkumavka (nedoporučuje se cínová fólie)
Označení vzorků: Skupina+replikace např. A1, A2, A3;B1, B2, B3......

Náklad:

1. Suchý led: Vzorky je třeba zabalit do sáčků a zahrabat do suchého ledu.
2. Zkumavky RNAstable: Vzorky RNA lze sušit ve zkumavce pro stabilizaci RNA (např. RNAstable®) a přepravovat při pokojové teplotě.

Tok servisní práce

Návrh experimentu

Vzorová dodávka

Extrakce RNA

Stavba knihovny

Sekvenování

Analýza dat

Poprodejní služby

Předchozí: Sekvenování eukaryotické mRNA-Illumina

Další: Sekvenování mRNA plné délky - Nanopore

1.FLNC rozdělení délek

Délka nechimérického čtení o plné délce (FLNC) udává délku cDNA v konstrukci knihovny.Distribuce délek FLNC je klíčovým ukazatelem při hodnocení kvality výstavby knihovny.

mRNA-FLNC-read-length-distribution

Distribuce délky čtení FLNC

2. Kompletní distribuce délky oblasti ORF

TransDecoder používáme k predikci oblastí kódujících protein a odpovídajících aminokyselinových sekvencí k vytvoření unigenových sad, které obsahují kompletní neredundantní transkriptové informace ve všech vzorcích.

mRNA-kompletní-ORF-délka-distribuce

Kompletní distribuce délky oblasti ORF

3. Analýza obohacení KEGG dráhy

Diferenciálně exprimované transkripty (DET) mohou být identifikovány porovnáním dat sekvenování RNA na bázi NGS na souborech transkriptů plné délky generovaných daty sekvenování PacBio.Tyto DET lze dále zpracovat pro různé funkční analýzy, např. analýzu obohacení KEGG dráhy.

mRNA-DEG-KEGG-cesta-obohacení

Obohacení dráhy DET KEGG -Dot plot

Pouzdro BMK

Vývojová dynamika transkriptomu kmene Populus

Publikováno: Plant Biotechnology Journal, 2019

Strategie sekvenování:
Kolekce vzorků:kmenové oblasti: vrchol, první internodium (IN1), druhé internodium (IN2), třetí internodium (IN3), internodium (IN4) a internodium (IN5) od Nanlin895
NGS sekvence:RNA 15 jedinců byla spojena jako jeden biologický vzorek.Tři biologické replikáty každého bodu byly zpracovány pro NGS sekvenci
Sekvence TGS:Kmenové oblasti byly rozděleny do tří oblastí, tj. apex, IN1-IN3 a IN4-IN5.Každá oblast byla zpracována pro sekvenování PacBio se čtyřmi typy knihoven: 0-1 kb, 1-2 kb, 2-3 kb a 3-10 kb.

Klíčové výsledky

1. Celkem bylo identifikováno 87150 transkriptů plné délky, ve kterých bylo identifikováno 2081 nových isoforem a 62058 nových alternativních sestřižených isoforem.
Bylo identifikováno 2,1187 lncRNA a 356 fúzních genů.
3. Od primárního růstu k sekundárnímu růstu bylo identifikováno 15838 odlišně exprimovaných transkriptů z 995 odlišně exprimovaných genů.Ve všech DEG bylo 1216 transkripčních faktorů, z nichž většina dosud nebyla popsána.
4. Analýza obohacení GO odhalila význam buněčného dělení a oxidačně-redukčního procesu v primárním a sekundárním růstu.