Sekvenování jednojádrové RNA
Technické schéma
Izolace jader se dosahuje pomocí 10× Genomics Chromium™, což je osmikanálový mikrofluidní systém s dvojitým křížením. V tomto systému jsou gelové kuličky s čárovými kódy a primerem, enzymy a jedno jádro zapouzdřeny v olejové kapce o velikosti nanolitru, čímž vzniká gelová emulze (GEM). Jakmile se GEM vytvoří, probíhá v každém GEM lýza buněk a uvolňování čárových kódů. mRNA jsou reverzně transkribovány do molekul cDNA s 10× čárovými kódy a UMI, které jsou dále podrobeny konstrukci standardní sekvenční knihovny.
Funkce
● Příprava suspenze jednotlivých jader ze zmrazených tkání
● Tvorba gelové kuličky v emulzi (GEM) s následnou syntézou cDNA
● Každá kulička v GEM je naplněna primery složenými ze 4 sekcí:
poly(dT) ocas pro mRNA priming a syntézu cDNA,
Jedinečný molekulární identifikátor (UMI) pro korekci zkreslení amplifikace
10x čárový kód
Vazebná sekvence sekvenčního primeru s částečným čtením 1
Výhody
Sekvenování jednojaderné RNA obchází omezení sekvenování jednobuněčné RNA a umožňuje:
● Použití zmrazených vzorků, nikoli pouze čerstvých vzorků
● Nízký stres zmrazených buněk ve srovnání s enzymatickou úpravou čerstvých buněk, což se odráží v transkriptomových datech ve formě menšího počtu genů indukovaných stresem
● Není nutné předchozí odebírání červených krvinek
● Neomezený průměr buňky
● Široké spektrum vzorků vhodných pro analýzu, včetně komplexních a křehkých typů tkání, které jsou náchylné ke shlukování buněk nebo destrukci během disociace tkání
Vzorky, které nelze analyzovat sekvenováním RNA jednotlivých buněk a které jsou vhodné pro sekvenování RNA jednotlivých jader:
| Buňka / Tkáň | Důvod |
| Nezmrazená tkáň | Nelze získat nové nebo dlouho uložené organizace |
| Svalová buňka, megakaryocyt, tuková buňka… | Průměr cely je příliš velký pro vstup do přístroje |
| Játra… | Příliš křehké na zlomení, neschopné rozlišit jednotlivé buňky |
| Neuron, mozek… | Citlivější, snadno stresovatelné, změní výsledky sekvenování |
| Slinivka břišní, štítná žláza… | Bohatý na endogenní enzymy, které ovlivňují produkci suspenze jednotlivých buněk |
Jednojádrový vs. jednobuněčný
| Jednojádrový | Jednobuněčný |
| Neomezený průměr buňky | Průměr buňky: 10–40 μm |
| Materiálem může být zmrazená tkáň | Materiál musí být z čerstvé tkáně |
| Nízký stres zmrazených buněk | Enzymatická léčba může způsobit stresovou reakci buněk |
| Není třeba odstraňovat žádné červené krvinky | Je třeba odstranit červené krvinky |
| Jaderný vyjadřuje bioinformaci | Celá buňka vyjadřuje bioinformace |
Specifikace
| Požadavky na vzorek | Knihovna | Strategie sekvenování | Doporučená data | Kontrola kvality |
| Živočišná tkáň ≥ 200 mg Rostlinná tkáň ≥ 400 mg | 10x knihovna cDNA Genomics sn | Illumina PE150 | 100 tisíc přečtení PE na buňku (100–200 GB) | 700–1200 jader/μl a celistvost jader pozorovaná pod mikroskopem |
Pro více informací o pokynech k přípravě vzorků a pracovním postupu služby se prosím neváhejte obrátit naExpert na BMKGENE
Pracovní postup služby
Zahrnuje následující analýzu:
● Kontrola kvality: počet buněk, detekce genů, přesná identifikace buněk, molekul RNA a kvantifikace exprese
● Analýza vnitřního vzorku:
Shlukování buněk a anotace shluků
Analýza diferenciální exprese: identifikace DEG v klastrech
Funkční anotace a obohacení stupňů stupňů klastru
● Meziskupinová analýza:
Kombinace dat
Analýza diferenciální exprese: identifikace DEG ve skupinách
Funkční anotace a obohacení skupinových stupňů stupně
● Pokročilá analýza:
Analýza buněčného cyklu
Pseudočasová analýza
Analýza buněčné komunikace (CellPhoneDB)
Analýza obohacení genové sady (GSEA)
Analýza vnitřního vzorku
Shlukování buněk:
Analýza diferenciální exprese: stupně stupňů klastrů
Meziskupinová analýza
Analýza diferenciální exprese: Skupinové stupně
Pokročilá analýza:
Analýza pseudočasu:
Analýza buněčného cyklu:
Prozkoumejte pokroky, které umožnily služby sekvenování jednojádrové RNA společnosti BMKGene od 10X Chromium, v těchto doporučených publikacích:
Wang, L. a kol. (2021) „Analýza transkriptomických buněk jednotlivých buněk odhaluje imunitní krajinu plic při exacerbaci astmatu rezistentního na steroidy“,Sborník Národní akademie věd Spojených států amerických, 118(2), s. e2005590118. doi: 10.1073/pnas.2005590118
Zheng, H. a kol. (2022) „Globální regulační síť pro dysregulovanou genovou expresi a abnormální metabolickou signalizaci v imunitních buňkách v mikroprostředí Gravesovy choroby a Hashimotovy tyreoiditidy“,Hranice v imunologii, 13, str. 879824. doi: 10.3389/FIMMU.2022.879824/BIBTEX.
Tian, H. a kol. (2023) „Jednobuněčný transkriptom odhaluje heterogenitu a imunitní odpovědi leukocytů po vakcinaci inaktivovanou bakterií Edwardsiella tarda u platýse bramborového (Paralichthys olivaceus)“,Akvakultura, 566, s. 739238. doi: 10.1016/J.AQUACULTURE.2023.739238.
Yu, Y. a kol. (2023) „Fotodynamická terapie zlepšuje výsledky inhibitorů imunitních kontrolních bodů prostřednictvím remodelace protinádorové imunity u pacientů s rakovinou žaludku“,Rakovina žaludku, 26(5), s. 798–813. doi: 10.1007/S10120-023-01409-X/METRIKY.
