Dilyniannu mRNA Hyd Llawn-Nanopor

MRNA Hyd Llawn Dilyniant - Delwedd Sylw Nanopore

Mae dilyniannu RNA wedi bod yn arf amhrisiadwy ar gyfer dadansoddiad trawsgrifio cynhwysfawr.Yn ddiamau, cyflawnodd dilyniannu darllen byr traddodiadol nifer o ddatblygiadau pwysig yma.Serch hynny, mae'n aml yn dod ar draws cyfyngiadau mewn adnabyddiaeth isoform hyd llawn, meintioli, gogwydd PCR.

Mae dilyniannu Nanopore yn gwahaniaethu ei hun oddi wrth lwyfannau dilyniannu eraill, yn yr ystyr bod y niwcleotidau yn cael eu darllen yn uniongyrchol heb synthesis DNA ac yn cynhyrchu darlleniad hir mewn degau o basau kilo.Mae hyn yn grymuso darllen allan uniongyrchol gan groesi trawsgrifiadau hyd llawn a mynd i'r afael â'r heriau mewn astudiaethau lefel isoform.

Platfform:Nanopore PromethION

Llyfrgell:cDNA-PCR

Cysylltwch â Ni

Manylion Gwasanaeth

Canlyniadau Demo

Astudiaeth Achos

Manteision Gwasanaeth

● Tuedd dilyniant isel

● Datgelu moleciwlau cDNA hyd llawn

● Mae angen llai o ddata i gwmpasu'r un nifer o drawsgrifiadau

● Adnabod isoformau lluosog fesul genyn

● Meintioli mynegiant ar lefel isoform

Manylebau Gwasanaeth

Llyfrgell

Platfform

Cynnyrch data a argymhellir (Gb)

Rheoli Ansawdd

cDNA-PCR (cyfoethogi Poly-A)

Nanopore PromethION P48

6 Gb/sampl (yn dibynnu ar rywogaethau)

Cymhareb hyd llawn ＞ 70%

Sgôr ansawdd cyfartalog: C10

Dadansoddiadau biowybodeg

●Prosesu data crai

● Adnabod trawsgrifiad

● Splicing amgen

● Meintioli mynegiant yn lefel genynnau a lefel isoform

● Dadansoddiad mynegiant gwahaniaethol

● Anodi a chyfoethogi ffwythiannau (DEGs a DETs)

Gofynion Sampl a Chyflenwi

Gofynion Sampl:

Niwcleotidau:

Conc.(ng/μl)

Swm (μg)

Purdeb

Uniondeb

≥ 100

≥ 0.6

OD260/280=1.7-2.5

OD260/230=0.5-2.5

Dangosir halogiad protein neu DNA cyfyngedig neu ddim o gwbl ar y gel.

Ar gyfer planhigion: RIN≥7.0;

Ar gyfer anifeiliaid: RIN≥7.5;

5.0≥28S/18S≥1.0;

drychiad gwaelodlin cyfyngedig neu ddim drychiad gwaelodlin

Meinwe: Pwysau (sych): ≥1 g

* Ar gyfer meinwe llai na 5 mg, rydym yn argymell anfon sampl meinwe wedi'i rewi â fflach (mewn nitrogen hylifol).

Ataliad celloedd: Cyfrif celloedd = 3×10⁶- 1×10⁷

* Rydym yn argymell llongio lysate cell wedi'i rewi.Rhag ofn bod y gell honno'n cyfrif llai na 5 × 10⁵, argymhellir fflach wedi'i rewi mewn nitrogen hylifol, sy'n well ar gyfer echdynnu micro.

Samplau gwaed: Cyfrol≥1 ml

Cyflwyno Sampl a Argymhellir

Cynhwysydd: tiwb centrifuge 2 ml (Ni argymhellir ffoil tun)

Labelu enghreifftiol: Grŵp+ at ei gilydd ee A1, A2, A3;B1, B2, B3......

Cludo: 2 、 Iâ sych: Mae angen pacio samplau mewn bagiau a'u claddu mewn rhew sych.

Tiwbiau RNAstable: Gellir sychu samplau RNA mewn tiwb sefydlogi RNA (ee RNAstable®) a'u cludo yn nhymheredd yr ystafell.

Llif Gwaith Gwasanaeth

Niwcleotidau:

Cyflwyno sampl

Adeiladu llyfrgell

Dilyniannu

Dadansoddi data

Gwasanaethau ôl-werthu

Llif Gwaith Gwasanaeth

Meinwe:

Dyluniad arbrawf

Cyflwyno sampl

echdynnu RNA

Adeiladu llyfrgell

Dilyniannu

Dadansoddi data

Gwasanaethau ôl-werthu

Pâr o: Dilyniant mRNA hyd llawn -PacBio

Nesaf: Trawsgrifiad Gofodol Visium Genomeg 10x

1.Dadansoddiad mynegiant gwahaniaethol -Plot llosgfynydd

Gellir prosesu dadansoddiad mynegiant gwahaniaethol ar lefel genynnau i nodi genynnau a fynegir yn wahaniaethol (DEGs) ac ar lefel isoform i adnabod yn wahaniaethol

3(1)

trawsgrifiadau wedi'u mynegi (DETs)

2.Map gwres clystyru hierarchaidd

Adnabod a dosbarthu splicing 3.Alternative

Gall Astalavista ragweld pum math o ddigwyddiadau splicing amgen.

4.Adnabod digwyddiadau aml-adynyleiddiad (APA) amgen a Motiff ar 50 bp i fyny'r afon o poly-A

Achos BMK

Adnabod splicing amgen a meintioli lefel isoform trwy ddilyniannu trawsgrifiad hyd llawn nanopor

Cyhoeddwyd:Cyfathrebu Natur, 2020

Strategaeth ddilyniannu:

Grwpio: 1. CLL-SF3B1(WT);2. CLL-SF3B1(treiglad K700E);3. B-gelloedd arferol

Strategaeth ddilyniannu: Dilyniannu llyfrgell MinION 2D, dilyniannu llyfrgell PromethION 1D;data darllen byr o'r un samplau

Llwyfan dilyniannu: Nanopore MinION;Nanopore PromethION;

Canlyniadau allweddol

1.Isoform-lefel Adnabod Splicing Amgen

Mae dilyniannau darllen hir yn galluogi adnabod mutant SF3B1^K700E-safleoedd sbleis wedi'u newid ar lefel isoform.Canfuwyd bod 35 o 3′SSs amgen a 10 amgen 5′SS wedi’u rhannu’n sylweddol wahaniaethol rhwng SF3B1^K700Ea SF3B1^WT.Roedd 33 o'r 35 o addasiadau newydd eu darganfod gan ddilyniannau darllen hir.

meintioliad Splicing Amgen 2.Isoform-lefel

Mynegiad o isffurfiau cadw intron (IR) yn SF3B1^K700Ea SF3B1^WTeu meintioli ar sail dilyniannau nanopor, gan ddatgelu is-reoleiddiad byd-eang o isoformau IR yn SF3B1^K700E.

Cyfeiriad

Tang AD , Soulette CM , Baren MJV , et al.Mae nodweddu trawsgrifiad hyd llawn o fwtaniad SF3B1 mewn lewcemia lymffosytig cronig yn datgelu is-reoleiddio intronau wrth gefn[J].Cyfathrebu Natur.