Αλληλουχία mRNA πλήρους μήκους - PacBio
Πλεονεκτήματα εξυπηρέτησης
● Άμεση ανάγνωση του μορίου cDNA πλήρους μήκους από το άκρο 3' έως το άκρο 5'
● Ανάλυση επιπέδου ισομορφής στη δομή ακολουθίας
● Μεταγραφές με υψηλή ακρίβεια και ακεραιότητα
● Εξαιρετικά συμβατό με είδη vaiours
● Μεγάλη χωρητικότητα αλληλουχίας με 4 πλατφόρμες αλληλούχισης PacBio Sequel II εξοπλισμένες
● Εξαιρετική εμπειρία με πάνω από 700 έργα αλληλουχίας RNA που βασίζονται στο Pacbio
● Παράδοση αποτελεσμάτων βάσει BMKCloud: Προσαρμοσμένη εξόρυξη δεδομένων διαθέσιμη στην πλατφόρμα.
● Οι υπηρεσίες μετά την πώληση ισχύουν για 3 μήνες από την ολοκλήρωση του έργου
Προδιαγραφές Υπηρεσίας
Πλατφόρμα: PacBio Sequel II
Βιβλιοθήκη αλληλουχίας: Βιβλιοθήκη mRNA εμπλουτισμένη με Poly A
Προτεινόμενη απόδοση δεδομένων: 20 Gb/δείγμα (Ανάλογα με το είδος)
FLNC (%): ≥75%
*FLNC: Πλήρους μήκους μη χιμαιρικές μεταγραφές
Βιοπληροφορικές αναλύσεις
● Επεξεργασία ακατέργαστων δεδομένων
● Αναγνώριση μεταγραφής
● Δομή ακολουθίας
● Ποσοτικοποίηση έκφρασης
● Σχολιασμός συνάρτησης
Απαιτήσεις δειγμάτων και παράδοση
Απαιτήσεις δειγμάτων:
Νουκλεοτίδια:
| Συμπ.(ng/μl) | Ποσότητα (μg) | Καθαρότητα | Ακεραιότητα |
| ≥ 120 | ≥ 0,6 | OD260/280=1,7-2,5 OD260/230=0,5-2,5 Περιορισμένη ή καθόλου μόλυνση πρωτεϊνών ή DNA που εμφανίζεται στο gel. | Για φυτά: RIN≥7,5; Για ζώα: RIN≥8,0; 5,0≥ 28S/18S≥1,0; περιορισμένη ή καθόλου βασική ανύψωση |
Ιστός: Βάρος (ξηρός):≥1 γρ
*Για ιστό μικρότερο από 5 mg, συνιστούμε να στείλετε δείγμα ιστού κατεψυγμένου (σε υγρό άζωτο).
Εναιώρημα κυττάρων:Αριθμός κυττάρων = 3×106- 1×107
*Συνιστούμε την αποστολή κατεψυγμένων κυτταρολυμάτων.Σε περίπτωση που αυτό το κελί μετράει μικρότερο από 5×105, συνιστάται η κατάψυξη σε υγρό άζωτο, το οποίο είναι προτιμότερο για μικροεκχύλιση.
Δείγματα αίματος:Όγκος≥1 mL
Μικροοργανισμός:Μάζα ≥ 1 g
Συνιστώμενη παράδοση δειγμάτων
Δοχείο:
Σωλήνας φυγοκέντρησης 2 ml (δεν συνιστάται αλουμινόχαρτο)
Επισήμανση δείγματος: Ομάδα+αντίγραφο π.χ. A1, A2, A3;Β1, Β2, Β3... ...
Αποστολή:
1. Ξηρός πάγος: Τα δείγματα πρέπει να συσκευάζονται σε σάκους και να ταφούν σε ξηρό πάγο.
2. Σωλήνες σταθεροί σε RNA: Τα δείγματα RNA μπορούν να στεγνώσουν σε σωλήνα σταθεροποίησης RNA (π.χ. RNAstable®) και να αποσταλούν σε θερμοκρασία δωματίου.
Ροή εργασιών εξυπηρέτησης
Σχεδιασμός πειράματος
Παράδοση δειγμάτων
Εκχύλιση RNA
Κατασκευή βιβλιοθήκης
Αλληλουχία
Ανάλυση δεδομένων
Υπηρεσίες μετά την πώληση
1.Κατανομή μήκους FLNC
Το μήκος πλήρους μήκους μη χιμαιρικής ανάγνωσης (FLNC) υποδεικνύει το μήκος του cDNA στην κατασκευή της βιβλιοθήκης.Η κατανομή μήκους FLNC είναι ένας κρίσιμος δείκτης για την αξιολόγηση της ποιότητας της κατασκευής της βιβλιοθήκης.
Κατανομή μήκους ανάγνωσης FLNC
2.Πλήρης κατανομή μήκους περιοχής ORF
Χρησιμοποιούμε το TransDecoder για να προβλέψουμε τις περιοχές κωδικοποίησης πρωτεϊνών και τις αντίστοιχες αλληλουχίες αμινοξέων για να δημιουργήσουμε σύνολα unigene, τα οποία περιέχουν πλήρεις μη περιττές πληροφορίες μεταγραφής σε όλα τα δείγματα.
Πλήρης κατανομή μήκους περιοχής ORF
3.Ανάλυση εμπλουτισμού μονοπατιού KEGG
Τα διαφορικά εκφρασμένα μεταγραφήματα (DETs) μπορούν να αναγνωριστούν ευθυγραμμίζοντας δεδομένα αλληλουχίας RNA που βασίζονται σε NGS σε σετ μεταγραφών πλήρους μήκους που δημιουργούνται από δεδομένα αλληλουχίας PacBio.Αυτά τα DET μπορούν να υποβληθούν σε περαιτέρω επεξεργασία για διάφορες λειτουργικές αναλύσεις, π.χ. ανάλυση εμπλουτισμού διαδρομής KEGG.
Εμπλουτισμός μονοπατιού DET KEGG - Οικόπεδο με τελείες
Θήκη BMK
Η αναπτυξιακή δυναμική του μεταγραφώματος του στελέχους Populus
Δημοσίευσε: Plant Biotechnology Journal, 2019
Στρατηγική αλληλουχίας:
Συλλογή δειγμάτων:βλαστικές περιοχές: κορυφή, πρώτος μεσογονάτιος (IN1), δεύτερος μεσογονάτιος (IN2), τρίτος μεσογονάτος (IN3), μεσογονίδιο (IN4) και μεσογονίδιο (IN5) από το Nanlin895
NGS-ακολουθία:RNA 15 ατόμων συγκεντρώθηκαν ως ένα βιολογικό δείγμα.Τρία βιολογικά αντίγραφα κάθε σημείου υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για την ακολουθία NGS
Ακολουθία TGS:Οι βλαστικές περιοχές χωρίστηκαν σε τρεις περιοχές, δηλαδή στην κορυφή, IN1-IN3 και IN4-IN5.Κάθε περιοχή υποβλήθηκε σε επεξεργασία για αλληλούχιση PacBio με τέσσερις τύπους βιβλιοθηκών: 0-1 kb, 1-2 kb, 2-3 kb και 3-10 kb.
Βασικά αποτελέσματα
1. Εντοπίστηκαν συνολικά 87150 μεταγραφές πλήρους μήκους, στις οποίες εντοπίστηκαν 2081 νέες ισομορφές και 62058 νέες εναλλακτικές ισομορφές ματίσματος.
Ταυτοποιήθηκαν 2,1187 lncRNA και 356 γονίδια σύντηξης.
3. Από την πρωτογενή ανάπτυξη στη δευτερογενή ανάπτυξη, αναγνωρίστηκαν 15838 διαφορικά εκφρασμένα μεταγραφήματα από 995 διαφορικά εκφρασμένα γονίδια.Σε όλες τις DEG, 1216 ήταν παράγοντες μεταγραφής, οι περισσότεροι από τους οποίους δεν έχουν ακόμη αναφερθεί.
Η ανάλυση εμπλουτισμού 4.GO αποκάλυψε τη σημασία της κυτταρικής διαίρεσης και της διαδικασίας οξείδωσης-αναγωγής στην πρωτογενή και δευτερογενή ανάπτυξη.
Εναλλακτικά συμβάντα ματίσματος και διαφορετικές ισομορφές
Ανάλυση WGCNA σε παράγοντες μεταγραφής
Αναφορά
Chao Q, Gao ZF, Zhang D, et al.Η αναπτυξιακή δυναμική του μεταγραφώματος του στελέχους Populus.Plant Biotechnol J. 2019;17(1):206-219.doi:10.1111/pbi.12958
