ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ
φύση
ΔΙΑΒΙΒΑΣΕΙΣ
Ο πλήρης χαρακτηρισμός μεταγραφής της μετάλλαξης SF3B1 στη χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία αποκαλύπτει μείωση της ρύθμισης των διατηρούμενων ιντρονίων
Ολόκληρες μεταγραφές|Αλληλουχία νανοπόρου|Εναλλακτική ανάλυση ισομορφών
Ιστορικό
SΟι οματικές μεταλλάξεις στον παράγοντα ματίσματος SF3B1 έχει ευρέως αναφερθεί ότι σχετίζονται με διάφορους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένης της χρόνιας λεμφοκυτταρικής λευχαιμίας (ΧΛΛ), του μελανώματος του ραγοειδούς, του καρκίνου του μαστού, κ.λπ.Ωστόσο, οι μελέτες σχετικά με αυτά τα εναλλακτικά μοτίβα ματίσματος έχουν περιοριστεί εδώ και πολύ καιρό σε επίπεδο συμβάντος και έλλειψη γνώσης σε επίπεδο ισομορφής λόγω του περιορισμού των συναρμολογημένων μεταγραφών σύντομης ανάγνωσης.Εδώ, η πλατφόρμα αλληλουχίας νανοπόρων εισήχθη για τη δημιουργία μεταγραφών πλήρους μήκους, οι οποίες ενίσχυσαν την αναθεώρηση σε ισομορφές AS.
Πειραματικό σχέδιο
Πειράματα
Ομαδοποίηση:1. CLL-SF3B1(WT) 2. CLL-SF3B1(μετάλλαξη K700E);3. Φυσιολογικά Β-κύτταρα
Στρατηγική αλληλουχίας:Αλληλουχία βιβλιοθήκης MinION 2D, αλληλουχία βιβλιοθήκης PromethION 1D.δεδομένα σύντομης ανάγνωσης από τα ίδια δείγματα
Πλατφόρμα αλληλουχίας:ΟΝΤ MinION?ONT PromethION;
Βιοπληροφορική Ανάλυση
Αποτελέσματα
ΕΝΑΣυνολικά 257 εκατομμύρια αναγνώσεις δημιουργήθηκαν από 6 δείγματα CLL και 3 Β-κύτταρα.Κατά μέσο όρο, το 30,5% αυτών των αναγνώσεων αναγνωρίστηκαν ως μεταγραφές πλήρους μήκους.
FΗ ολοκληρωμένη εναλλακτική ανάλυση ισομορφών του RNA (FLAIR) αναπτύχθηκε για τη δημιουργία ενός συνόλου ισομορφών υψηλής εμπιστοσύνης.Το FLAIR μπορεί να συνοψιστεί ως εξής:
Nanopore διαβάζει στοίχιση: προσδιορίστε τη γενική δομή μεταγραφής με βάση το γονιδίωμα αναφοράς.
SΔιόρθωση διασταύρωσης ρίψεων: διορθώστε τα σφάλματα ακολουθίας (κόκκινο) με τη θέση ματίσματος είτε από σχολιασμένα εσώνια, εσώνια από δεδομένα σύντομης ανάγνωσης ή και τα δύο.
Cσύμπτυξη: συνοψίστε αντιπροσωπευτικές ισομορφές που βασίζονται σε αλυσίδες σύνδεσης ματίσματος (σύνολο πρώτου περάσματος).Επιλέξτε isof από υψηλής εμπιστοσύνης με βάση τον αριθμό των υποστηρικτικών αναγνώσεων (Threshold: 3).
Εικόνα 1. Ανάλυση FLAIR για τον εντοπισμό ισομορφών πλήρους μήκους που σχετίζονται με μετάλλαξη SF3B1 στη ΧΛΛ
FLAIR Προσδιόρισε 326.699 ματισμένες ισομορφές υψηλής εμπιστοσύνης, το 90% των οποίων είναι νέες ισομορφές.Οι περισσότερες από αυτές τις μη σχολιασμένες ισομορφές βρέθηκαν να είναι νέοι συνδυασμοί γνωστών συνδέσμων ματίσματος (142.971), ενώ οι υπόλοιπες νέες ισομορφές περιείχαν είτε διατηρημένο εσώνιο (21.700) είτε νέο εξόνιο (3594).
LΟι αλληλουχίες που διαβάζονται ong-read εξουσιοδοτούν την ταυτοποίηση μεταλλαγμένων θέσεων ματίσματος SF3B1-K700E σε επίπεδο ισομορφής.35 εναλλακτικά 3'SS και 10 εναλλακτικά 5'SS βρέθηκαν να είναι σημαντικά διαφοροποιημένα μεταξύ SF3B1-K700E και SF3B1-WT.33 από τις 35 αλλοιώσεις ανακαλύφθηκαν πρόσφατα από μακροχρόνιες αναγνωσμένες ακολουθίες.Στα δεδομένα Nanopore, η κατανομή της απόστασης μεταξύ των αλλαγμένων από SF3B1-K700E 3'SS έως τις κορυφές κανονικών τοποθεσιών είναι περίπου -20 bp, η οποία διαφέρει σημαντικά από μια κατανομή ελέγχου, παρόμοια με αυτή που έχει αναφερθεί σε ακολουθίες σύντομης ανάγνωσης CLL.Οι ισομορφές του γονιδίου ERGIC3 αναλύθηκαν, όπου μια νέα ισομορφή που περιέχει την εγγύς θέση ματίσματος βρέθηκε πιο άφθονη στο SF3B1-K700E.Τόσο το εγγύς όσο και το περιφερικό 3'SS συσχετίστηκαν με διακριτά μοτίβα AS που παράγουν πολλαπλές ισομορφές.
Εικόνα 2. Εναλλακτικά μοτίβα ματίσματος 3' που προσδιορίζονται με δεδομένα αλληλουχίας νανοπόρου
Η ανάλυση χρήσης συμβάντων IR ήταν εδώ και πολύ καιρό περιορισμένη στην ανάλυση που βασίζεται σε σύντομη ανάγνωση λόγω της εμπιστοσύνης στον προσδιορισμό και την ποσοτικοποίηση IR.Η έκφραση των ισομορφών IR σε SF3B1-K700E και SF3B1-WT ποσοτικοποιήθηκε με βάση αλληλουχίες νανοπόρου, αποκαλύπτοντας μια συνολική προς τα κάτω ρύθμιση των ισομορφών IR στο SF3B1-K700E.
Σχήμα 4. Ένταση γεωργίας και συνδεσιμότητα δικτύου σε τρία γεωργικά συστήματα (Α και Β).Τυχαία ανάλυση δασών (C) και σχέση μεταξύ αγροτικής έντασης και αποικισμού AMF (D)
Εικόνα 3. Τα συμβάντα κατακράτησης ιντρονίων ρυθμίζονται πιο έντονα στο CLL SF3B1-K700E
Τεχνολογία
Nanpore Long-read Sequencing
NΗ αλληλουχία ανοπόρων είναι μια τεχνολογία αλληλουχίας ηλεκτρικού σήματος ενός μορίου σε πραγματικό χρόνο.
DΤο δίκλωνο DNA ή RNA θα συνδεθεί με τη νανοπορώδη πρωτεΐνη που είναι ενσωματωμένη στο βιοφίλμ και θα ξετυλιχθεί υπό την καθοδήγηση της πρωτεΐνης κινητήρα.
DΟι κλώνοι NA/RNA περνούν μέσω της πρωτεΐνης καναλιού νανοπόρου με συγκεκριμένο ρυθμό υπό τη δράση της διαφοράς τάσης.
MΤα μόρια παράγουν διαφορετικά ηλεκτρικά σήματα ανάλογα με τη χημική δομή.
RΗ ανίχνευση σε πραγματικό χρόνο των ακολουθιών επιτυγχάνεται με κλήση βάσης.
Εκτέλεση πλήρους μήκους αλληλουχίας μεταγραφώματος
√ Κορεσμός δεδομένων
Απαιτούνται 7 φορές λιγότερες αναγνώσεις για να επιτευχθεί συγκρίσιμος κορεσμός δεδομένων.
√ Αναγνώριση δομής μεταγραφής
Προσδιορισμός διαφορετικών δομικών παραλλαγών με συναινετική ανάγνωση πλήρους μήκους κάθε μεταγραφής
√ Διαφορική ανάλυση σε επίπεδο μεταγραφής - Αποκάλυψη αλλαγών που κρύβονται από σύντομες αναγνώσεις
Αναφορά
Tang AD, Soulette CM, Baren MJV, et al.Ο χαρακτηρισμός μεταγραφής πλήρους μήκους της μετάλλαξης SF3B1 στη χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία αποκαλύπτει μείωση της ρύθμισης των κατακρατημένων ιντρονίων [J].Επικοινωνίες για τη φύση.
Tech and Highlights στοχεύει στην κοινή χρήση των πιο πρόσφατων επιτυχημένων εφαρμογών διαφορετικών τεχνολογιών αλληλουχίας υψηλής απόδοσης σε διάφορους τομείς έρευνας καθώς και λαμπρών ιδεών στον πειραματικό σχεδιασμό και την εξόρυξη δεδομένων.
Ώρα δημοσίευσης: Ιαν-08-2022