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Secuenciación de ARNm de longitud completa -PacBio

De novosecuenciación del transcriptoma de longitud completa, también conocida comoDe novoIso-Seq aprovecha las ventajas del secuenciador PacBio en cuanto a longitud de lectura, lo que permite la secuenciación de moléculas de ADNc de longitud completa sin interrupciones.Esto evita por completo cualquier error generado en los pasos de ensamblaje de la transcripción y construye conjuntos unigenes con resolución a nivel de isoforma.Este conjunto unigene proporciona información genética poderosa como "genoma de referencia" a nivel de transcriptoma.Además, al combinarse con datos de secuenciación de próxima generación, este servicio permite una cuantificación precisa de la expresión a nivel de isoformas.

Plataforma: PacBio Secuela II
Biblioteca: biblioteca de campana SMRT

  • :
  • Detalles del servicio

    Resultados de la demostración

    Caso de estudio

    Ventajas del servicio

    2

    ● Lectura directa de la molécula de ADNc de longitud completa desde el extremo 3' al extremo 5'

    ● Resolución de nivel de isoforma en estructura de secuencia

    ● Transcripciones con alta precisión e integridad.

    ● Altamente compatible con diversas especies.

    ● Gran capacidad de secuenciación con 4 plataformas de secuenciación PacBio Sequel II equipadas

    ● Alta experiencia con más de 700 proyectos de secuenciación de ARN basados ​​en Pacbio

    ● Entrega de resultados basada en BMKCloud: minería de datos personalizada disponible en la plataforma.

    ● Servicios posventa válidos por 3 meses una vez finalizado el proyecto.

    Especificaciones de servicio

    Plataforma: PacBio Secuela II

    Biblioteca de secuenciación: biblioteca de ARNm enriquecida con poli A

    Rendimiento de datos recomendado: 20 Gb/muestra (Dependiendo de la especie)

    FLNC(%): ≥75%

    *FLNC: transcripciones completas no quiméricas

    Análisis bioinformáticos.

    ● Procesamiento de datos sin procesar
     
    ● Identificación de transcripción
     
    ● Estructura de secuencia
     
    ● Cuantificación de expresiones
     
    ● Anotación de función

    pacbio de cuerpo entero

    Requisitos de muestra y entrega

    Requisitos de muestra:

    Nucleótidos:

    Conc.(ng/μl)

    Cantidad (μg)

    Pureza

    Integridad

    ≥ 120

    ≥ 0,6

    DO260/280=1,7-2,5

    DO260/230=0,5-2,5

    En el gel se muestra contaminación limitada o nula de proteínas o ADN.

    Para plantas: RIN≥7,5;

    Para animales: RIN≥8,0;

    5,0≥ 28S/18S≥1,0;

    elevación basal limitada o nula

    Tejido: Peso (seco):≥1 gramos
    *Para tejido de menos de 5 mg, recomendamos enviar una muestra de tejido congelada instantáneamente (en nitrógeno líquido).

    Suspensión celular:Recuento de células = 3×106- 1×107
    *Recomendamos enviar lisado celular congelado.En caso de que la celda cuente menos de 5×105, se recomienda la congelación instantánea en nitrógeno líquido, que es preferible para la microextracción.

    Muestras de sangre:Volumen≥1 ml

    Microorganismo:Masa ≥ 1 g

    Entrega de muestra recomendada

    Envase:
    Tubo de centrífuga de 2 ml (no se recomienda papel de aluminio)
    Etiquetado de muestras: Grupo+réplica, por ejemplo, A1, A2, A3;B1, B2, B3... ...

    Envío:

    1. Hielo seco: las muestras deben empaquetarse en bolsas y enterrarse en hielo seco.
    2. Tubos RNAstable: las muestras de ARN se pueden secar en un tubo de estabilización de ARN (por ejemplo, RNAstable®) y enviarse a temperatura ambiente.

    Flujo de trabajo del servicio

    Control de calidad de muestra

    Diseño de experimentos

    entrega de muestra

    Entrega de muestra

    experimento piloto

    extracción de ARN

    Preparación de la biblioteca

    construcción de biblioteca

    Secuenciación

    Secuenciación

    Análisis de los datos

    Análisis de los datos

    Servicios postventa

    Servicios postventa


  • Anterior:
  • Próximo:

  • 1.Distribución de longitud FLNC

    La longitud de la lectura no quimérica completa (FLNC) indica la longitud del ADNc en la construcción de la biblioteca.La distribución de longitud del FLNC es un indicador crucial para evaluar la calidad de la construcción de la biblioteca.

    Distribución de longitud de lectura de ARNm-FLNC

    Distribución de longitud de lectura FLNC

    2.Distribución completa de longitud de la región ORF

    Utilizamos TransDecoder para predecir regiones codificantes de proteínas y las secuencias de aminoácidos correspondientes para generar conjuntos unigenes, que contienen información de transcripción completa no redundante en todas las muestras.

    Distribución-de-longitud-ORF-completa-de-ARNm

    Distribución completa de longitud de la región ORF

    3.Análisis de enriquecimiento de la vía KEGG

    Las transcripciones expresadas diferencialmente (DET) se pueden identificar alineando los datos de secuenciación de ARN basados ​​en NGS en conjuntos de transcripciones completos generados por los datos de secuenciación de PacBio.Estos DET pueden procesarse adicionalmente para diversos análisis funcionales, por ejemplo, análisis de enriquecimiento de la vía KEGG.

    Enriquecimiento de la vía-ARNm-DEG-KEGG

    Enriquecimiento de la vía DET KEGG: diagrama de puntos

    Caso BMK

    La dinámica del desarrollo del transcriptoma de la raíz de Populus.

    Publicado: Revista de biotecnología vegetal, 2019

    Estrategia de secuenciación:
    Coleccion de muestra:regiones del tallo: ápice, primer entrenudo (IN1), segundo entrenudo (IN2), tercer entrenudo (IN3), entrenudo (IN4) y entrenudo (IN5) de Nanlin895
    Secuencia NGS:Se reunió el ARN de 15 individuos como una muestra biológica.Se procesaron tres réplicas biológicas de cada punto para la secuencia NGS.
    Secuencia TGS:Las regiones del tallo se dividieron en tres regiones, es decir, ápice, IN1-IN3 e IN4-IN5.Cada región se procesó para la secuenciación PacBio con cuatro tipos de bibliotecas: 0-1 kb, 1-2 kb, 2-3 kb y 3-10 kb.

    Resultados clave

    1. Se identificaron un total de 87150 transcripciones completas, en las cuales se identificaron 2081 isoformas novedosas y 62058 isoformas empalmadas alternativas novedosas.
    Se identificaron 2,1187 lncRNA y 356 genes de fusión.
    3. Desde el crecimiento primario hasta el crecimiento secundario, se identificaron 15838 transcripciones expresadas diferencialmente de 995 genes expresados ​​diferencialmente.En todos los DEG, 1216 eran factores de transcripción, la mayoría de los cuales aún no se han informado.
    4.El análisis de enriquecimiento de GO reveló la importancia de la división celular y el proceso de oxidación-reducción en el crecimiento primario y secundario.

    • PB-estudio-de-caso-de-secuenciación-de-ARN-completo-de-longitud-completa

      Eventos de empalme alternativos y diferentes isoformas.

    • PB-empalme-alternativo-de-ARN-de-longitud-completa

      Análisis WGCNA sobre factores de transcripción.

    Referencia

    Chao Q, Gao ZF, Zhang D, et al.La dinámica del desarrollo del transcriptoma de la raíz de Populus.Plant Biotechnol J. 2019;17(1):206-219.doi:10.1111/pbi.12958

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