BMKCloudi sisselogimine

Tooted

Ühe tuuma RNA sekveneerimine

Üksikute rakkude püüdmise ja kohandatud teekide loomise tehnikate väljatöötamine koos suure läbilaskevõimega sekveneerimisega on muutnud geeniekspressiooni uuringuid raku tasandil revolutsiooniliselt. See läbimurre võimaldab keeruliste rakupopulatsioonide sügavamat ja põhjalikumat analüüsi, ületades geeniekspressiooni keskmistamisega seotud piirangud kõigi rakkude ulatuses ja säilitades nende populatsioonide tegeliku heterogeensuse. Kuigi üksikute rakkude RNA sekveneerimisel (scRNA-seq) on vaieldamatud eelised, on sellel väljakutseid teatud kudedes, kus üksikrakulise suspensiooni loomine osutub keeruliseks ja nõuab värskeid proove. BMKGene'is lahendame selle takistuse, pakkudes ühetuumalise RNA sekveneerimist (snRNA-seq), kasutades tipptasemel 10X Genomics Chromium tehnoloogiat. See lähenemisviis laiendab transkriptoomi analüüsiks sobivate proovide spektrit üksikraku tasandil.

Tuumade isoleerimine toimub uuendusliku 10X Genomics Chromium kiibi abil, millel on kaheksakanaliline mikrofluidikasüsteem kahekordse ristumise ja läbimisega. Selles süsteemis kapseldatakse nanoliitri suurustesse õlitilkadesse geelgraanulid, mis sisaldavad vöötkoode, praimereid, ensüüme ja ühte tuuma, moodustades geelgraanulite emulsiooni (GEM). Pärast GEM-i moodustumist toimub igas GEM-is rakkude lüüs ja vöötkoodi vabanemine. Seejärel läbivad mRNA molekulid pöördtranskriptsiooni cDNA-deks, mis sisaldavad 10X vöötkoode ja unikaalseid molekulaarseid identifikaatoreid (UMI-sid). Seejärel allutatakse need cDNA-d standardsele sekveneerimisteegi konstrueerimisele, mis hõlbustab geeniekspressiooni profiilide põhjalikku ja põhjalikku uurimist üksikraku tasandil.

Platvorm: 10× Genomics Chromium ja Illumina NovaSeq platvorm

Võta meiega ühendust

Teenuse üksikasjad

Bioinformaatika

Demo tulemused

Soovitatud väljaanded

Tehniline skeem

Tuumade isoleerimine saavutatakse 10× Genomics Chromium™ abil, mis koosneb kaheksakanalilisest mikrofluidikasüsteemist kahekordse ristumise abil. Selles süsteemis kapseldatakse nanoliitri suurusesse õlitilga sisse geelgraanulid koos vöötkoodide ja praimeriga, ensüümid ja üksik tuum, genereerides geelgraanulite emulsiooni (GEM). Kui GEM on moodustunud, toimub rakkude lüüs ja vöötkoodide vabastamine igas GEM-is. mRNA pöördtranskribeeritakse cDNA molekulideks 10× vöötkoodide ja UMI-ga, mida seejärel standardselt sekveneeritakse.

Omadused

● Ühetuumalise suspensiooni valmistamine külmutatud kudedest

● Geelhelmeste emulsioonis (GEM) moodustumine, millele järgneb cDNA süntees

● Iga GEM-i graanul on laetud praimeritega, mis koosnevad neljast sektsioonist:

polü(dT) saba mRNA praimimiseks ja cDNA sünteesiks,

Unikaalne molekulaarne identifikaator (UMI) amplifikatsiooni kallutatuse korrigeerimiseks

10x vöötkood

Osaliselt loetud 1 sekveneerimispraimeri sidumisjärjestus

Eelised

Ühetuumalise RNA sekveneerimine aitab vältida üherakulise RNA sekveneerimise piiranguid, võimaldades:

● Külmutatud proovide kasutamine, mitte ainult värskete proovide kasutamine

● Külmutatud rakkude madal stress võrreldes värskete rakkude ensümaatilise töötlemisega, mis kajastub transkriptoomi andmetes stressist tingitud geenide väiksema arvuna

● Punaste vereliblede eelnev eemaldamine pole vajalik

● Piiramatu lahtri läbimõõt

● Suur hulk analüüsiks sobivaid proove, sh keerulised ja haprad koetüübid, mis on kudede dissotsiatsiooni ajal altid rakkude klombistumisele või hävimisele

Proovid, mida ei saa analüüsida üksikrakulise RNA sekveneerimisega ja mis sobivad üksikutumalise RNA sekveneerimiseks:

Rakk / kude	Põhjus
Värskelt külmutatud kude	Värskeid või kaua salvestatud organisatsioone ei õnnestunud hankida
Lihasrakk, megakarüotsüüt, rasvrakk…	Raku läbimõõt on instrumenti sisenemiseks liiga suur
Maksa…	Liiga habras, et puruneda, ei suuda üksikuid rakke eristada
Neuronrakk, aju…	Tundlikum, kergemini stressi allutatav, muudab sekveneerimise tulemusi
Kõhunääre, kilpnääre…	Rikas endogeensete ensüümide poolest, mis mõjutavad üksikrakkude suspensiooni tootmist

Ühetuumne vs üherakuline

Ühetuumaline	Üherakuline
Piiramatu lahtri läbimõõt	Rakkude läbimõõt: 10–40 μm
Materjal võib olla külmutatud kude	Materjal peab olema värske kangas
Külmutatud rakkude madal stress	Ensüümravi võib põhjustada rakkude stressireaktsiooni
Punaseid vereliblesid pole vaja eemaldada	Punased verelibled tuleb eemaldada
Tuumaenergia väljendab bioinformatsiooni	Kogu rakk väljendab bioinformatsiooni

Spetsifikatsioonid

Näidisnõuded

Raamatukogu

Järjestusstrateegia

Soovitatavad andmed

Kvaliteedikontroll

Loomkude ≥ 200 mg

Taimekude ≥ 400 mg

10x Genomicsi sn cDNA raamatukogu

Illumina PE150

100 000 PE lugemist raku kohta

(100–200 Gb)

700–1200 tuuma/μl ja tuumade terviklikkus mikroskoobi all

Proovi ettevalmistamise juhiste ja teenuse töövoo kohta lisateabe saamiseks võtke julgelt ühendustBMKGENE ekspert

Teenuse töövoog

Eelmine: Taime/looma kogu genoomi sekveneerimine

Järgmine: Genoomiülene assotsiatsioonianalüüs

Sisaldab järgmist analüüsi:

● Kvaliteedikontroll: rakkude arv, geenide tuvastamine, rakkude täpne identifitseerimine, RNA molekulid ja ekspressiooni kvantifitseerimine

● Sisemise proovi analüüs:

Rakkude klasterdamine ja klastri annotatsioon

Diferentsiaalse ekspressiooni analüüs: DEG-de tuvastamine klastrites

Klastri DEG-de funktsionaalne annotatsioon ja rikastamine

● Rühmadevaheline analüüs:

Andmete kombineerimine

Diferentsiaalse ekspressiooni analüüs: DEG-de tuvastamine rühmades

Rühma DEG-de funktsionaalne annotatsioon ja rikastamine

● Täpsem analüüs:

Rakutsükli analüüs

Pseudoaja analüüs

Mobiilside analüüs (CellPhoneDB)

Geenikomplekti rikastamise analüüs (GSEA)

Sisemise valimi analüüs

Rakkude klasterdumine:

Diferentsiaalse ekspressiooni analüüs: klastri DEG-d

Rühmadevaheline analüüs

Diferentsiaalse ekspressiooni analüüs: grupi DEG-d

Täpsem analüüs:

Pseudoaja analüüs:

Rakutsükli analüüs:

Avastage nendes esiletõstetud väljaannetes edusamme, mida on hõlbustanud BMKGene'i ühetuumalise RNA sekveneerimisteenused 10X Chromiumi abil:

Wang, L. jt (2021) „Üherakulise transkriptoomilise analüüsi abil selgub kopsude immuunmaastik steroidiresistentse astma ägenemise korral“,Ameerika Ühendriikide Riikliku Teaduste Akadeemia toimetised, 118(2), lk e2005590118. doi: 10.1073/pnas.2005590118

Zheng, H. jt (2022) „Globaalne regulatiivne võrgustik düsreguleeritud geeniekspressiooni ja ebanormaalse metaboolse signaaliülekande jaoks immuunrakkudes Gravesi tõve ja Hashimoto türeoidiidi mikrokeskkonnas“,Immunoloogia piirid, 13, lk. 879824. doi: 10.3389/FIMMU.2022.879824/BIBTEX.

Tian, H. jt (2023) „Üherakuline transkriptoom paljastab lesta (Paralichthys olivaceus) leukotsüütide heterogeensuse ja immuunvastused pärast vaktsineerimist inaktiveeritud Edwardsiella tardaga“,Vesiviljelus, 566, lk 739238. doi: 10.1016/J.AQUACULTURE.2023.739238.

Yu, Y. jt (2023) „Fotodünaamiline teraapia parandab immuunsüsteemi kontrollpunkti inhibiitorite tulemusi, remodelleerides kasvajavastast immuunsust maovähiga patsientidel“,Mao vähk, 26(5), lk 798–813. doi: 10.1007/S10120-023-01409-X/METRICS.