Luzera osoko mRNA sekuentziazioa-Nanoporoa
Zerbitzu Abantailak
● Sekuentzia-alborapen baxua
● Luzera osoko cDNA molekulak agerian jartzea
● Datu gutxiago behar diren espediente kopuru bera estaltzeko
● Gene bakoitzeko isoforma anitz identifikatzea
● Adierazpenen kuantifikazioa isoforma mailan
Zerbitzuaren zehaztapenak
| Liburutegia | Plataforma | Gomendatutako datu-errendimendua (Gb) | Kalitate kontrola |
| cDNA-PCR (Poly-A aberastua) | Nanopore PromethION P48 | 6 Gb/lagin (espeziearen arabera) | Luzera osoko ratioa >% 70 Kalitatearen batez besteko puntuazioa: Q10
|
Bioinformatikako analisiak
●Datu gordinak prozesatzea
● Transkripzioaren identifikazioa
● Ejuntura alternatiboa
● Espresioaren kuantifikazioa gene mailan eta isoforma mailan
● Adierazpen diferentzialaren analisia
● Funtzioen oharpena eta aberastea (DEG eta DET)
Lagin-baldintzak eta entrega
Lagin-baldintzak:
Nukleotidoak:
| Konk. (ng/μl) | Kantitatea (μg) | Garbitasuna | Osotasuna |
| ≥ 100 | ≥ 0,6 | OD260/280=1,7-2,5 OD260/230=0,5-2,5 Gelan agertzen da proteina edo DNA kutsadura mugatua edo ez. | Landareetarako: RIN≥7,0; Animalientzat: RIN≥7,5; 5.0≥28S/18S≥1.0; Oinarrizko kota mugatua edo ez |
Ehuna: Pisua (lehorra): ≥1 g
*5 mg baino txikiagoak diren ehunetarako, izoztutako (nitrogeno likidoan) ehun lagina bidaltzea gomendatzen dugu.
Zelula esekidura: Zelula kopurua = 3×106- 1×107
* Izoztutako zelula lisatua bidaltzea gomendatzen dugu.Gelaxka hori 5×10 baino txikiagoa bada5, nitrogeno likidoan izoztutako flasha gomendatzen da, eta hori hobe da mikro erauzketarako.
Odol laginak: Bolumena≥1 ml
Laginaren entrega gomendatua
Ontzia: 2 ml zentrifugatzaile-hodia (ez da gomendagarria eztainu-papera)
Laginaren etiketatzea: Taldea+erreplika, adibidez, A1, A2, A3;B1, B2, B3....
Bidalketa: 2, izotz lehorra: laginak poltsetan sartu eta izotz lehorrean lurperatu behar dira.
- RNAstable hodiak: RNA laginak RNA egonkortzeko hodi batean lehortu daitezke (adibidez, RNAstable®) eta giro-tenperaturan bidal daitezke.
Zerbitzuaren Lan Fluxua
Nukleotidoak:
Laginaren entrega
Liburutegiaren eraikuntza
Sekuentziazioa
Datuen azterketa
Salmenta osteko zerbitzuak
Zerbitzuaren Lan Fluxua
Ehuna:
Esperimentuen diseinua
Laginaren entrega
RNA erauzketa
Liburutegiaren eraikuntza
Sekuentziazioa
Datuen azterketa
Salmenta osteko zerbitzuak
1.Adierazpen diferentzialaren analisia -Sumendien grafikoa
Adierazpen diferentzialaren analisia bi gene mailan prozesatu daiteke modu ezberdinean adierazitako geneak (DEG) identifikatzeko eta isoforma mailan desberdintasunez identifikatzeko.
Adierazitako transkripzioak (DET)
2.Klusterketa hierarkikoa bero-mapa
3.Splicing alternatiboaren identifikazioa eta sailkapena
Bost splicing gertaera alternatibo mota aurreikus ditzake Astalavistak.
4.Poli-adenilazio alternatiboa (APA) gertaeren identifikazioa eta motiboa 50 bp poli-A-tik gora
BMK kasua
Splicing identifikazio alternatiboa eta isoforma-mailako kuantifikazioa nanoporoen luzera osoko transkriptomaren sekuentziazioaren bidez
Argitaratu:Nature Communications, 2020
Sekuentziazio estrategia:
Taldekatzea: 1. CLL-SF3B1(WT);2. CLL-SF3B1 (K700E mutazioa);3. B-zelula normalak
Sekuentziazio estrategia: MinION 2D liburutegiaren sekuentziazioa, PromethION 1D liburutegiaren sekuentziazioa;lagin bereko datuak laburki irakurri
Sekuentziazio plataforma: Nanopore MinION;Nanopore PromethION;
Emaitza nagusiak
1.Isoforma mailako splicing identifikazio alternatiboa
Irakurketa luzeko sekuentziak SF3B1 mutantearen identifikazioa ahalbidetzen duK700E-Splitze guneak aldatuak isoforma mailan.35 alternatiba 3′SS eta 10 alternatiba 5′SS SF3B1-en artean modu ezberdinean lotzen zirela aurkitu zen.K700Eeta SF3B1WT.35 alterazioetatik 33 luze irakurritako sekuentzien bidez aurkitu ziren.
2.Isoforma maila Alternative Splicing kuantifikazioa
Introi atxikipena (IR) isoformen adierazpena SF3B1eanK700Eeta SF3B1WTnanoporoen sekuentzietan oinarrituta kuantifikatu ziren, SF3B1-en IR isoformen beheranzko erregulazio globala agerian utziz.K700E.
Erreferentzia
Tang AD, Soulette CM, Baren MJV, et al.Leuzemia linfozitiko kronikoko SF3B1 mutazioaren transkripzio osoko karakterizazioak agerian uzten du atxikitako introien beheranzko erregulazioa [J].Natura Komunikazioak.
