PacBio 2+3 mRNA osoko soluzioa
Ezaugarriak
● Ikerketaren diseinua:
PacBio-rekin sekuentziatutako lagin multzoa transkripzio-isoformak identifikatzeko
Lagin bereiziak (erreplikatuak eta probatu beharreko baldintzak) sekuentziatutaNGS transkripzioen adierazpena kuantifikatzeko
● PacBio sekuentziazioa CCS moduan, HiFi irakurketak sortuz
● Transkripzio osoen sekuentziazioa
● Analisiak ez du erreferentziazko genomarik behar; hala ere, erabil daiteke
● Bioinformatika-analisiak ez du gene eta isoforma mailan adierazpena bakarrik barne hartzen, baita lncRNAren, gene-fusioen, poliadenilazioen eta gene-egituraren analisia ere.
Abantailak
● Zehaztasun handiaHiFi irakurketak %99,9tik gorako zehaztasunarekin (Q30), NGSren parekoa
● Splicing alternatiboen analisiaTranskripzio guztiak sekuentziatzeak isoformen identifikazioa eta karakterizazioa ahalbidetzen du.
● PacBio eta NGS indarguneen konbinazioaIsoforma mailan adierazpena kuantifikatzea ahalbidetzen du, geneen adierazpen osoa aztertzean ezkutatuta egon daitezkeen aldaketak agerian utziz.
● Esperientzia zabala2300 lagin baino gehiago prozesatu ditugu, gure taldeak esperientzia handia ekartzen dio proiektu bakoitzari.
● Salmenta osteko laguntzaGure konpromisoa proiektua amaitu baino haratago doa, 3 hilabeteko salmenta osteko zerbitzuarekin. Denbora horretan, proiektuaren jarraipena, arazoak konpontzeko laguntza eta emaitzekin lotutako edozein zalantza argitzeko galdera-erantzun saioak eskaintzen ditugu.
Laginaren eskakizunak eta entrega
| Liburutegia | Sekuentziazio estrategia | Gomendatutako datuak | Kalitate Kontrola |
| PolyA-n aberastutako mRNA CCS liburutegia | PacBio Jarraipena II PacBio Revio | 20/40 Gb 5/10 M CCS | Q30≥85% |
| Poli A aberastua | Illumina PE150 | 6-10 Gb | Q30≥85% |
Nukleotidoak
|
| Kontzentrazioa (ng/μl) | Kopurua (μg) | Garbitasuna | Osotasuna |
| Illumina liburutegia | ≥ 10 | ≥ 0,2 | OD260/280=1.7-2.5 OD260/230=0.5-2.5 Proteina edo DNA kutsadura mugatua edo batere ez da agertzen gelean. | Landareentzat: RIN≥4.0; Animalientzat: RIN≥4.5; 5.0≥28S/18S≥1.0; oinarrizko kota mugatua edo batere ez |
| PacBio liburutegia | ≥ 100 | ≥ 1.0 | OD260/280=1.7-2.5 OD260/230=0.5-2.5 Proteina edo DNA kutsadura mugatua edo batere ez da agertzen gelean. | Landareak: RIN≥7.5 Animaliak: RIN≥8.0 5.0≥28S/18S≥1.0; oinarrizko kota mugatua edo batere ez |
Gomendatutako lagin-bidalketa
Ontzia: 2 ml-ko zentrifugazio-hodia (ez da gomendatzen eztainu-papera erabiltzea)
Laginaren etiketatzea: Taldekatu+erreplikatu, adibidez, A1, A2, A3; B1, B2, B3.
Bidalketa:
1. Izotz lehorra:Laginak poltsetan sartu eta izotz lehorrean lurperatu behar dira.
2. RNA egonkortzeko hodiak: RNA laginak RNA egonkortzeko hodi batean (adibidez, RNAstable®) lehortu eta giro-tenperaturan bidali daitezke.
Honako analisi hauek barne hartzen ditu:
- Datu gordinak
- Kalitate kontrola
- Poliadenilazio Analisi Alternatiboa (APA)
- Fusio-transkripzioen analisia
- Splicing alternatiboen analisia
- Ortologo Unibertsal Bakarreko Kopia (BUSCO) analisi erreferentziazkoa
- Transkripzioen analisi berria: kodetze-sekuentzien iragarpena (CDS) eta funtzio-anotazioa
- lncRNAren analisia: lncRNAren eta jomugen iragarpena
- Mikrosateliteen identifikazioa (SSR)
- Transkripzio Diferentzialki Adierazien (DET) analisia
- Gene Diferentzialki Adierazien (DEG) analisia
- DEG eta DETen funtzionalitate-anotazioa
BUSCOren analisia
Splicing alternatiboen analisia
Poliadenilazio Analisi Alternatiboa (APA)
Gene Diferentzialki Adierazitakoak (DEG) eta Transkripzioak (DETs9 analisia)
DET eta DEG-en proteina-proteina interakzio sareak
Arakatu BMKGene-ren PacBio 2+3 mRNA sekuentziazio osoak ahalbidetutako aurrerapenak argitalpen bilduma zaindu baten bidez.
Chao, Q. et al. (2019) 'Populus zurtoin transkriptomaren garapen-dinamika',Landareen Bioteknologia Aldizkaria, 17(1), 206–219 orr. doi: 10.1111/PBI.12958.
Deng, H. et al. (2022) 'Actinidia latifoliaren (askorbatoan aberatsa den fruta-laborea) fruituen garapenean eta heltzean azido askorbiko edukiaren aldaketa dinamikoak eta lotutako mekanismo molekularrak',Nazioarteko Zientzia Molekularreko Aldizkaria, 23.(10), or. 5808. doi: 10.3390/IJMS23105808/S1.
Hua, X. et al. (2022) 'Paris polyphylla-ko polifilin bioaktiboetan parte hartzen duten bide biosintetikoen geneen iragarpen eraginkorra',Komunikazio Biologia2022 5:1, 5(1), 1–10 orr. doi: 10.1038/s42003-022-03000-z.
Liu, M. et al. (2023) 'Tuta absoluta (Meyrick) transkriptomaren eta zitokromo P450 geneen PacBio Iso-Seq eta Illumina RNA-Seq analisi konbinatua',Intsektuak, 14(4), 363. or. doi: 10.3390/INSECTS14040363/S1.
Wang, Lijun et al. (2019) 'Transkriptomaren konplexutasunaren azterketa bat PacBio molekula bakarreko denbora errealeko analisia erabiliz Illumina RNA sekuentziazioarekin konbinatuta, Ricinus communis-en azido rizinoleikoaren biosintesia hobeto ulertzeko',BMC Genomika, 20(1), 1–17 orr. doi: 10.1186/S12864-019-5832-9/FIGURES/7.
