Nukleo bakarreko RNA sekuentziazioa
Eskema Teknikoa
Nukleoen isolamendua 10× Genomics Chromium™-ekin lortzen da, zortzi kanaleko mikrofluidika sistema bat, gurutzaketa bikoitzekin. Sistema honetan, barra-kodeak eta primerrak dituen gel-aleak, entzimak eta nukleo bakarra nanolitro tamainako olio-tanta batean kapsulatzen dira, Gel Bead-in-Emulsion (GEM) sortuz. GEMak eratu ondoren, zelulen lisia eta barra-kodeen askapena egiten dira GEM bakoitzean. mRNA alderantziz transkribatzen da cDNA molekuletan 10× barra-kodeekin eta UMIrekin, eta hauek sekuentziazio-liburutegi estandarraren eraikuntzari men egiten diote.
Ezaugarriak
● Ehun izoztuetatik nukleo bakarreko suspentsioaren prestaketa
● Gel Bead-in-Emultsioaren (GEM) eraketa, eta ondoren cDNA sintesia
● GEM bateko ale bakoitza 4 atalez osatutako primerrez kargatuta dago:
poli(dT) isatsa mRNAren abiarazte eta cDNAren sintesirako,
Anplifikazioaren alborapena zuzentzeko Identifikatzaile Molekular Bakarra (UMI)
10x barra-kodea
1. irakurketa partzialaren sekuentziazio-primerraren lotura-sekuentzia
Abantailak
Nukleo bakarreko RNA sekuentziazioak zelula bakarreko RNA sekuentziazioaren mugak saihesten ditu, eta honako hau ahalbidetzen du:
● Lagin izoztuen erabilera, eta ez lagin freskoetara mugatuta soilik
● Zelula izoztuen estres baxua zelula freskoen tratamendu entzimatikoarekin alderatuta, transkriptoma datuetan islatuta dagoena estres gutxiago eragindako geneen moduan.
● Ez da beharrezkoa globulu gorriak aldez aurretik kentzea
● Zelula-diametro mugagabea
● Analisirako egokiak diren lagin sorta zabala, ehunen disoziazioan zehar zelulak pilatzeko edo suntsitzeko joera duten ehun mota konplexu eta hauskorrak barne.
Zelula bakarreko RNA sekuentziazioaren bidez aztertu ezin diren eta nukleo bakarreko RNA sekuentziaziorako egokiak diren laginak:
| Zelula / Ehuna | Arrazoia |
| Ehun izoztua desfreskatu | Ezin dira erakunde berriak edo aspaldi gordetakoak lortu |
| Gihar zelula, megakariozitoa, gantza… | Zelularen diametroa handiegia da tresnan sartzeko |
| Gibela… | Hauskorregia hausteko, ezinezkoa zelula bakarrak bereiztea |
| Neurona zelula, garuna… | Sentikorragoa, erraz estresatzen da, sekuentziazioaren emaitzak aldatuko ditu |
| Pankrea, tiroide… | Zelula bakarreko esekiduraren ekoizpenean eragina duten entzima endogenoetan aberatsa |
Nukleo bakarreko vs. zelulabakarra
| Nukleo bakarreko | Zelula bakarreko |
| Zelula-diametro mugagabea | Zelularen diametroa: 10-40 μm |
| Materiala ehun izoztua izan daiteke | Materiala ehun freskoa izan behar da |
| Zelula izoztuen tentsio baxua | Entzima-tratamenduak zelulen estres-erreakzioa eragin dezake |
| Ez da beharrezkoa globulu gorririk kentzea | Globulu gorriak kendu behar dira |
| Nuklearrak bioinformazioa adierazten du | Zelula osoak bioinformazioa adierazten du |
Zehaztapenak
| Laginaren eskakizunak | Liburutegia | Sekuentziazio estrategia | Gomendatutako datuak | Kalitate Kontrola |
| Animalia-ehuna ≥ 200 mg Landare-ehuna ≥ 400 mg | 10x Genomika sn ADNc liburutegia | Illumina PE150 | 100.000 PE irakurketa zelula bakoitzeko (100-200 Gb) | 700-1200 nukleo/μl eta nukleoen osotasuna mikroskopiopean behatuta |
Laginak prestatzeko gidalerroei eta zerbitzu-lan-fluxuari buruzko xehetasun gehiago lortzeko, jar zaitez harremanetan...BMKGENE aditua
Zerbitzuaren lan-fluxua
Honako analisi hauek barne hartzen ditu:
● Kalitate Kontrola: zelula kopurua, geneen detekzioa, zelulen identifikazio zehatza, RNA molekulak eta espresio kuantifikazioa
● Barne Laginaren Analisia:
Zelulen multzokatzea eta multzoen anotazioa
Adierazpen Diferentzialaren Analisia: DEGen identifikazioa klusterretan
Kluster DEGen anotazio funtzionala eta aberastea
● Talde arteko analisia:
Datuen konbinazioa.
Adierazpen Diferentzialaren Analisia: DEGen identifikazioa taldeetan
Taldeko DEGen anotazio funtzionala eta aberastea
● Analisi Aurreratua:
Zelulen zikloaren analisia
Denbora-pseudoaren analisia
Zelula komunikazioaren analisia (CellPhoneDB)
Gene Multzoaren Aberastearen Analisia (GSEA)
Barne-laginaren analisia
Zelulen multzokatzea:
Adierazpen Diferentzialaren Analisia: kluster DEGak
Taldeen arteko analisia
Adierazpen Diferentzialaren Analisia: Taldeko DEGak
Analisi Aurreratua:
Denbora-pseudoaren analisia:
Zelula zikloaren analisia:
Arakatu BMKGene-ren nukleo bakarreko RNA sekuentziazio zerbitzuek 10X Chromium-ek ahalbidetutako aurrerapenak argitalpen aipagarri hauetan:
Wang, L. et al. (2021) 'Zelula bakarreko transkriptomen analisiak biriketako sistema immunologikoaren paisaia agerian uzten du esteroideekiko erresistentea den asma larriagotzean',Ameriketako Estatu Batuetako Zientzien Akademia Nazionalaren jarduerak, 118(2), or. e2005590118. doi: 10.1073/pnas.2005590118
Zheng, H. et al. (2022) 'Gravesen gaixotasunaren eta Hashimotoren tiroiditisaren mikroinguruneko zelula immuneetan geneen adierazpen desregulatuaren eta seinaleztapen metaboliko anormalaren arautze-sare globala',Immunologiaren mugak, 13, or. 879824. doi: 10.3389/FIMMU.2022.879824/BIBTEX.
Tian, H. et al. (2023) 'Zelula bakarreko transkriptomak leukozitoen heterogeneotasuna eta erantzun immunologikoak agerian uzten ditu Edwardsiella tarda inaktibatuarekin txertoa jaso ondoren, platuxan (Paralichthys olivaceus)',Akuikultura, 566, 739238 or. doi: 10.1016/J.AQUACULTURE.2023.739238.
Yu, Y. et al. (2023) 'Terapia fotodinamikoak immunitate-kontroleko inhibitzaileen emaitza hobetzen du urdaileko minbizia duten pazienteen tumoreen aurkako immunitatea birmoldatuz',Urdaileko minbizia, 26(5), 798–813 orr. doi: 10.1007/S10120-023-01409-X/METRICS.
