Yksiytiminen RNA-sekvensointi
Tekninen kaavio
Ydineristys saadaan aikaan 10× Genomics Chromium™ -tekniikalla, joka koostuu kahdeksankanavaisesta mikrofluidiikkajärjestelmästä kaksoisristeyksillä. Tässä järjestelmässä geelihelmet, joissa on viivakoodeja ja alukkeita, entsyymejä ja yksi ydin kapseloituna nanolitran kokoiseen öljypisaraan, jolloin muodostuu GEM (Gel Bead-in-Emulsion) -emulsio. Kun GEM on muodostettu, solulyysi ja viivakoodien vapauttaminen suoritetaan jokaisessa GEM:ssä. mRNA käänteistranskriptoidaan cDNA-molekyyleiksi 10-kertaisilla viivakoodeilla ja UMI:lla, jotka ovat edelleen standardinmukaisen sekvensointikirjaston rakentamisen alaisia.
Ominaisuudet
● Yksitumaisen suspension valmistus jäädytetyistä kudoksista
● Gel Bead-in-Emulsion (GEM) muodostuminen, jota seuraa cDNA-synteesi
● Jokainen GEM-helmi on ladattu alukkeilla, jotka koostuvat 4 osasta:
poly(dT)-häntä mRNA-aloitusta ja cDNA-synteesiä varten,
Unique Molecular Identifier (UMI) vahvistaa amplifikaatiota
10x viivakoodi
Osittain luetun 1 sekvensointialukkeen sitoutumissekvenssi
Edut
Yksiytiminen RNA-sekvensointi kiertää yksisoluisen RNA-sekvensoinnin rajoitukset, mikä mahdollistaa:
● Pakastettujen näytteiden käyttö ei rajoitu pelkästään tuoreisiin näytteisiin
● Jäädytettyjen solujen alhainen stressi verrattuna tuoreiden solujen entsymaattiseen käsittelyyn, heijastuu transkriptitietoihin vähemmän stressin aiheuttamien geenien muodossa
● Punasoluja ei tarvitse poistaa etukäteen
● Rajoittamaton kennohalkaisija
● Suuri joukko näytteitä, jotka voidaan analysoida, mukaan lukien monimutkaiset ja hauraat kudostyypit, jotka ovat alttiita solujen paakkuuntumiseen tai tuhoutumiseen kudosten dissosioitumisen aikana
Näytteet, joita ei voida analysoida yksisoluisen RNA-sekvensoinnilla ja jotka ovat kelvollisia yksittäisten ytimien RNA-sekvensointiin:
| Solu / kudos | Syy |
| Tuore jäädytetty pehmopaperi | Uusia tai kauan tallennettuja organisaatioita ei voida saada |
| Lihassolut, Megakaryosyytit, Rasva… | Solun halkaisija on liian suuri laitteeseen pääsemiseksi |
| Maksa… | Liian hauras murtumaan, ei pysty erottamaan yksittäisiä soluja |
| Neuronisolut, aivot… | Herkempi, helppo stressata, muuttaa sekvensointituloksia |
| Haima, kilpirauhanen… | Sisältää runsaasti endogeenisiä entsyymejä, jotka vaikuttavat yksisolususpension tuotantoon |
Yksiytiminen vs yksisoluinen
| Yksiytiminen | Yksisoluinen |
| Rajoittamaton solun halkaisija | Solun halkaisija: 10-40 μm |
| Materiaali voi olla pakastettua kudosta | Materiaalin tulee olla tuoretta pehmopaperia |
| Jäädytettyjen solujen alhainen stressi | Entsyymikäsittely voi aiheuttaa solustressireaktion |
| Punasoluja ei tarvitse poistaa | Punasolut on poistettava |
| Ydinvoima ilmaisee bioinformaatiota | Koko solu ilmaisee bioinformaatiota |
Tekniset tiedot
| Esimerkkivaatimukset | Kirjasto | Sekvensointistrategia | Tietoja suositellaan | Laadunvalvonta |
| Eläinkudos ≥ 200 mg Kasvikudos ≥ 400 mg | 10x Genomics sn -cDNA-kirjasto | Illumina PE150 | 100 000 PE-lukua solua kohden (100-200 Gt) | 700-1200 ydintä/μl ja ytimien eheys havaittu mikroskoopilla |
Saat lisätietoja näytteiden valmistelun ohjeista ja palvelun työnkulusta ottamalla yhteyttä aBMKGENE asiantuntija
Palvelun työnkulku
Sisältää seuraavan analyysin:
● Laadunvalvonta: solujen lukumäärä, geenien havaitseminen, tarkka solujen tunnistaminen, RNA-molekyylit ja ilmentymisen kvantifiointi
● Sisäinen näyteanalyysi:
Soluklusterointi ja klusterin annotaatio
Differentiaalinen ilmaisuanalyysi: DEG:ien tunnistaminen klustereissa
Funktionaalinen huomautus ja klusterin DEG:ien rikastaminen
● Ryhmien välinen analyysi:
Tietojen yhdistelmä
Differentiaalinen ilmentymisanalyysi: DEG:ien tunnistaminen ryhmissä
Ryhmä-DEG:iden toiminnallinen huomautus ja rikastus
● Tarkennettu analyysi:
Solusyklianalyysi
Pseudoaika-analyysi
Soluviestintäanalyysi (CellPhoneDB)
Geenisarjan rikastusanalyysi (GSEA)
Sisäinen otosanalyysi
Soluklusterointi:
Differentiaalinen lausekeanalyysi: klusteri DEGs
Ryhmien välinen analyysi
Differentiaalinen ilmaisuanalyysi: Ryhmä DEG:t
Tarkennettu analyysi:
Pseudoaika-analyysi:
Solusyklianalyysi:
Tutustu BMKGenen 10X Chromiumin yhden ytimen RNA-sekvensointipalvelujen edistämiin edistysaskeliin näissä esitellyissä julkaisuissa:
Wang, L. et ai. (2021) "Yksisoluinen transkriptominen analyysi paljastaa keuhkojen immuunijärjestelmän steroidiresistentin astman pahenemisvaiheessa",Proceedings of the National Academy of Sciences of the United of America, 118(2), s. e2005590118. doi: 10.1073/pnas.2005590118
Zheng, H. et ai. (2022) Maailmanlaajuinen sääntelyverkosto geenien epäsääntelyä ja epänormaalia metabolista signalointia varten immuunisoluissa Gravesin taudin ja Hashimoton kilpirauhastulehduksen mikroympäristössä,Immunologian rajat, 13, s. 879824. doi: 10.3389/FIMMU.2022.879824/BIBTEX.
Tian, H. et ai. (2023) "Yksisoluinen transkripti paljastaa leukosyyttien heterogeenisyyden ja immuunivasteet kampelan (Paralichthys olivaceus) inaktivoidulla Edwardsiella tardalla rokotuksen jälkeen",Vesiviljely, 566, s. 739238. doi: 10.1016/J.AQUACULTURE.2023.739238.
Yu, Y. et ai. (2023) "Fotodynaaminen terapia parantaa immuunijärjestelmän tarkistuspisteen estäjien tuloksia uudistamalla kasvaintenvastaista immuniteettia potilailla, joilla on mahasyöpä",Mahasyöpä, 26(5), s. 798–813. doi: 10.1007/S10120-023-01409-X/METRICS.
