Seicheamhú mRNA Lánfhaid-Nanópóir
Buntáistí Seirbhíse
● Laofacht seicheamh íseal
● Móilíní cDNA lánfhad a nochtadh
● Níos lú sonraí a theastaíonn chun an líon céanna tras-scríbhinní a chlúdach
● Aithint na n-il-isfhoirmeacha in aghaidh na géine
● Cainníochtú slonn i leibhéal isoform
Sonraíochtaí Seirbhíse
| Leabharlann | Ardán | Toradh sonraí molta (Gb) | Rialú Cáilíochta |
| cDNA-PCR(Poly-A saibhrithe) | Nanopore PromethION P48 | 6 Gb/sampla (Ag brath ar speiceas) | Cóimheas fad iomlán ＞70% Meánscór cáilíochta: C10
|
Anailísí bithfhaisnéisíochta
●Próiseáil sonraí amh
● Aithint tras-scríbhinne
● Splicing malartach
● Cainníochtú slonn i leibhéal géine agus leibhéal isiseform
● Anailís difreálach ar chaint
● Anótáil agus saibhriú feidhmeanna (DEGanna agus DETanna)
Riachtanais Samplacha agus Seachadadh
Riachtanais Shamplacha:
Núicléatídí:
| Conc.(ng/μl) | Méid (μg) | Íonachta | Ionracas |
| ≥ 100 | ≥ 0.6 | OD260/280=1.7-2.5 OD260/230=0.5-2.5 Éilliú próitéine nó DNA teoranta nó gan aon a thaispeáint ar fhoirmiú. | I gcás plandaí: RIN≥7.0; I gcás ainmhithe: RIN≥7.5; 5.0≥28S/18S≥1.0; ingearchló bunlíne teoranta nó gan aon |
Fíochán: Meáchan (tirim): ≥1 g
* I gcás fíocháin níos lú ná 5 mg, molaimid sampla fíocháin reoite (i nítrigin leachtach) a sheoladh.
Fionraí cille: Comhaireamh cille = 3×106- 1×107
* Molaimid lysate cille reoite a longáil.Sa chás go n-áireofar an chill sin níos lú ná 5×105, moltar flash reoite i nítrigine leachtach, rud is fearr le haghaidh micrea-eastóscadh.
Samplaí fola: Imleabhar≥1 ml
Seachadadh Samplach Molta
Coimeádán: feadán lártheifneoir 2 ml (Ní mholtar scragall stáin)
Lipéadú samplach: Grúpa+ a mhacasamhlú m.sh. A1, A2, A3;B1, B2, B3...
Loingsiú: 2 、 Oighear tirim: Ní mór samplaí a phacáil i málaí agus a chur faoi oighear tirim.
- Feadáin RNAstable: Is féidir samplaí RNA a thriomú i bhfeadán cobhsaíochta RNA (eg RNAstable®) agus iad a sheoladh i dteocht an tseomra.
Sreabhadh Oibre Seirbhíse
Núicléatídí:
Seachadadh samplach
Tógáil leabharlainne
Seicheamhú
Anailís sonraí
Seirbhísí iar-díola
Sreabhadh Oibre Seirbhíse
Eitinn:
Dearadh turgnaimh
Seachadadh samplach
eastóscadh RNA
Tógáil leabharlainne
Seicheamhú
Anailís sonraí
Seirbhísí iar-díola
1.Anailís léiriú difreálach - plota bolcán
Is féidir anailís ar shloinne difreálach a phróiseáil ag leibhéal na géine chun géinte a chuirtear in iúl go difreálach (DEGanna) a aithint agus ar leibhéal isisefhoirmeach chun sainaithint difreálach a dhéanamh.
tras-scríbhinní sainráite (DETs)
2.Mapa teasa cnuasaithe ordlathach
Sainaithint agus aicmiú splicing 3.Alternative
Is féidir le Astalavista cúig chineál imeachtaí splicing malartacha a thuar.
4.Sainaithint teagmhais il-adeylation Malartach (APA) agus Móitíf ag 50 bp in aghaidh an tsrutha ó il-A
Cás BMK
Sainaithint mhalartach spliceála agus cainníochtú ar leibhéal isfhoirme trí sheicheamh tras-scríobhach lán-fhad nana-pór
Foilsithe:Cumarsáid Dúlra, 2020
Straitéis seicheamhaithe:
Grúpáil: 1. CLL-SF3B1(WT);2. CLL-SF3B1(K700E sóchán);3. Gnáth B-chealla
Straitéis seicheamhaithe: seicheamhú leabharlainne MinION 2D, seicheamhú leabharlainne PromethION 1D;sonraí gearr-léite ó na samplaí céanna
Ardán seicheamhaithe: Nanopore MinION;Nanopore PromethION;
Príomhthorthaí
Aitheantas Splicing Malartach 1.Isoform-level
Cumasaíonn seichimh fhada léite an tsóiteáin SF3B1 a shainaithintK700E-suíomhanna splice athraithe ag leibhéal isoform.Fuarthas amach go raibh difríocht shuntasach idir 35 rogha 3′SS agus 10 rogha 5′SS idir SF3B1K700Eagus SF3B1WT.Fuarthas 33 de na 35 athrú le seichimh fadléithe as an nua.
Cainníochtú Splicing Malartach 2.Isoform-level
Iseformanna coinneála intron(IR) a shloinneadh in SF3B1K700Eagus SF3B1WTa chainníochtú bunaithe ar sheichimh nanópóir, ag nochtadh íosrialáil dhomhanda ar isfhoirmeacha IR in SF3B1K700E.
Tagairt
Tang AD , Soulette CM , Baren MJV , et al.Nochtann tréithriú tras- lánfhad ar shóchán SF3B1 i leoicéime limficíteach ainsealach íosrialáil intéirrínigh[J].Cumarsáid Dúlra.
