Seicheamh mRNA làn-fhad -PacBio
Buannachdan seirbheis
● Leughadh dìreach de mholacile cDNA làn-fhad bho 3'- deireadh gu deireadh 5'-
● Fuasgladh ìre Iso-form ann an structar sreath
● Ath-sgrìobhaidhean le fìor chruinneas agus ionracas
● Àrd-fhreagarrach airson gnèithean vaiours
● Comas mòr sreathach le 4 àrd-ùrlaran sreathachaidh PacBio Sequel II uidheamaichte
● Eòlas fìor mhath le còrr air 700 pròiseact sreathachaidh RNA stèidhichte air Pacbio
● Lìbhrigeadh toradh stèidhichte air BMKCloud: Mèinneadh dàta gnàthaichte ri fhaighinn air àrd-ùrlar.
● Seirbheisean às dèidh reic dligheach airson 3 mìosan nuair a bhios am pròiseact deiseil
Sònrachaidhean seirbheis
Àrd-ùrlar: PacBio Sequel II
Leabharlann seicheamhan: Leabharlann mRNA le beairteas poly A
Toradh dàta a thathar a’ moladh: 20 Gb / sampall (A rèir gnè)
FLNC（%）: ≥75%
* FLNC: Tar-chuiridhean neo-chimeric làn-fhaid
Mion-sgrùdadh bioinformatics
● Giullachd dàta amh
● Comharrachadh tar-sgrìobhadh
● Structar sreathach
● Meudachadh Expression
● Annotation gnìomh
Sampall riatanasan agus lìbhrigeadh
Sampall Riatanasan:
Nucleotides:
| Conc.(ng/μl) | Suim (μg) | Purity | Ionracas |
| ≥ 120 | ≥ 0.6 | OD260/280=1.7-2.5 OD260/230=0.5-2.5 Pròtain cuibhrichte no gun truailleadh DNA air a nochdadh air gel. | Airson lusan: RIN≥7.5; Do bheathaichean: RIN≥8.0; 5.0≥ 28S/18S≥1.0; àrdachadh bun-loidhne cuingealaichte no gun a bhith ann |
Meud: Cuideam (tioram):≥1 g
* Airson clò nas lugha na 5 mg, tha sinn a’ moladh sampall clò reòta (ann an nitrogen leaghaidh) a chuir.
Crochadh cealla:Cunntas cealla = 3 × 106- 1 × 107
* Tha sinn a’ moladh lysate cealla reòta a chuir air falbh.Ma tha an cealla sin nas lugha na 5 × 105, thathas a’ moladh flash reòta ann an nitrogen leaghaidh, a tha nas fheàrr airson meanbh-tharraing.
Samhlaidhean fuil:Meud ≥1 mL
Microorganism:Aifreann ≥ 1 g
Lìbhrigeadh sampall air a mholadh
Container:
Tiùb centrifuge 2 ml (chan eilear a’ moladh foil staoin)
Bileag sampaill: Buidheann + ath-riochdachadh me A1, A2, A3;B1, B2, B3......
Gluasad:
1. Dry-deigh: Feumaidh sampaill a bhith air am pacadh ann am pocannan agus air an tiodhlacadh ann an deigh tioram.
2. Tiùban RNAstable: Faodar sampallan RNA a thiormachadh ann an tiùb seasmhach RNA (me RNAstable®) agus a chuir a-steach aig teòthachd an t-seòmair.
Sruth Obrach Seirbheis
Dealbhadh deuchainn
Lìbhrigeadh sampall
às-tharraing RNA
Togalach leabharlainn
Seicheamh
Mion-sgrùdadh dàta
Seirbheisean às deidh reic
Sgaoileadh fad 1.FLNC
Tha fad leughaidh neo-chimeric làn-fhaid (FLNC) a’ comharrachadh fad cDNA ann an togail leabharlainn.Tha cuairteachadh faid FLNC na chomharra deatamach ann a bhith a’ measadh càileachd togail leabharlainn.
Sgaoileadh fad leughaidh FLNC
2.Complete ORF sgaoileadh fad sgìre
Bidh sinn a’ cleachdadh TransDecoder gus roinnean còdaidh pròtain agus sreathan aminoideach co-fhreagarrach a ro-innse gus seataichean unigene a ghineadh, anns a bheil fiosrachadh tar-sgrìobhaidh iomlan nach eil feumach anns a h-uile sampall.
Cuir crìoch air cuairteachadh fad sgìre ORF
3.KEGG mion-sgrùdadh beairteachadh slighe
Faodar tar-sgrìobhaidhean air an cur an cèill gu eadar-dhealaichte (DETn) a chomharrachadh le bhith a’ co-thaobhadh dàta seicheamh RNA stèidhichte air NGS air seataichean tar-sgrìobhaidh làn-ùine air an gineadh le dàta sreathachaidh PacBio.Faodar na DETn sin a phròiseasadh tuilleadh airson diofar mhion-sgrùdadh gnìomh, me mion-sgrùdadh beairteachadh slighe KEGG.
Saibhreas slighe DET KEGG - Cuilbheart dot
Cùis BMK
Tha daineamaigs leasachaidh an tar-sgrìobhaidh gas Populus
Foillsichte: Iris Bith-theicneòlas Lusan, 2019
Ro-innleachd sreathachaidh:
Cruinneachadh sampall:roinnean gas: apex, a’ chiad internode (IN1), an dàrna internode (IN2), an treas internode (IN3), internode (IN4) agus internode (IN5) bho Nanlin895
NGS-sreath:Chaidh RNA de 15 neach a thoirt còmhla mar aon sampall bith-eòlasach.Chaidh trì mac-samhail bith-eòlasach de gach puing a ghiullachd airson sreath NGS
TGS-sreath:Chaidh roinnean gas a roinn ann an trì roinnean, ie apex, IN1-IN3 agus IN4-IN5.Chaidh gach roinn a phròiseasadh airson sreath PacBio le ceithir seòrsan de leabharlannan: 0-1 kb, 1-2 kb, 2-3 kb agus 3-10 kb.
Prìomh thoraidhean
1.Chaidh 87150 tar-sgrìobhaidhean làn-fhaid a chomharrachadh, anns an deach 2081 isoforms nobhail agus 62058 isoforman spliced eile a chomharrachadh.
Chaidh ginean 2.1187 lncRNA agus 356 fusion a chomharrachadh.
3. Bho fhàs bun-sgoile gu fàs àrd-sgoile, chaidh 15838 ath-sgrìobhaidhean eadar-dhealaichte bho 995 ginean air an cur an cèill gu eadar-dhealaichte a chomharrachadh.Anns a h-uile DEG, bha 1216 nam factaran tar-sgrìobhaidh, agus cha deach a’ mhòr-chuid dhiubh aithris fhathast.
Nochd mion-sgrùdadh beairteachaidh 4.GO cudromachd roinneadh cealla agus pròiseas lughdachadh oxidation ann am fàs bun-sgoile agus àrd-sgoile.
Tachartasan splicing eile agus diofar isoforms
Mion-sgrùdadh WGCNA air factaran tar-sgrìobhaidh
Iomradh
Chao Q, Gao ZF, Zhang D, et al.Tha daineamaigs leasachaidh an tar-sgrìobhaidh gas Populus.Bith-theicneòlas Lusan J. 2019; 17(1): 206-219.doi: 10.1111/pbi.12958
