Produtos

Secuenciación de ARN de núcleo único

O desenvolvemento de técnicas de captura de células individuais e construción de bibliotecas personalizadas, xunto coa secuenciación de alto rendemento, revolucionou os estudos da expresión xénica a nivel celular. Este avance permite unha análise máis profunda e completa de poboacións celulares complexas, superando as limitacións asociadas coa media da expresión xénica en todas as células e preservando a verdadeira heteroxeneidade dentro destas poboacións. Aínda que a secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) ten vantaxes innegables, atopa desafíos en certos tecidos onde a creación dunha suspensión unicelular resulta difícil e require mostras frescas. En BMKGene, abordamos este obstáculo ofrecendo secuenciación de ARN de núcleo único (snRNA-seq) utilizando a tecnoloxía de vangarda 10X Genomics Chromium. Esta abordaxe amplía o espectro de mostras susceptibles de análise do transcriptoma a nivel unicelular.

O illamento de núcleos realízase mediante o innovador chip 10X Genomics Chromium, que presenta un sistema microfluídico de oito canles con dobres cruces. Dentro deste sistema, as esferas de xel que incorporan códigos de barras, cebadores, encimas e un só núcleo encápsulanse en pingas de aceite do tamaño de nanolitros, formando esferas de xel en emulsión (GEM). Tras a formación do GEM, prodúcese a lise celular e a liberación do código de barras dentro de cada GEM. Posteriormente, as moléculas de ARNm sofren unha transcrición inversa en ADNc, incorporando códigos de barras 10X e identificadores moleculares únicos (UMI). Estes ADNc sométense entón á construción dunha biblioteca de secuenciación estándar, o que facilita unha exploración robusta e completa dos perfís de expresión xénica a nivel unicelular.

Plataforma: 10× Plataforma Xenómica de Cromo e Illumina NovaSeq

Contacta connosco

Detalles do servizo

Bioinformática

Resultados da demostración

Publicacións destacadas

Esquema técnico

O illamento dos núcleos conséguese mediante 10× Genomics Chromium™, que consiste nun sistema microfluídico de oito canais con dobres cruces. Neste sistema, unhas esferas de xel con códigos de barras e cebador, encimas e un único núcleo encápsanse nunha pinga de aceite do tamaño dun nanolitro, xerando esferas de xel en emulsión (GEM). Unha vez formados os GEM, a lise celular e a liberación dos códigos de barras realízanse en cada GEM. Os ARNm transcríbense inversamente en moléculas de ADNc con códigos de barras 10× e UMI, que posteriormente se someten á construción dunha biblioteca de secuenciación estándar.

Características

● Preparación de suspensións de núcleo único a partir de tecidos conxelados

● Formación de perlas de xel en emulsión (GEM) seguida de síntese de ADNc

● Cada esfera dun GEM está cargada con cebadores compostos por 4 seccións:

cola poli(dT) para a iniciación do ARNm e a síntese de ADNc,

Identificador Molecular Único (UMI) para corrixir o sesgo de amplificación

Código de barras 10x

Secuencia de unión do cebador de secuenciación de lectura parcial 1

Vantaxes

A secuenciación de ARN dun só núcleo evita as limitacións da secuenciación de ARN dunha soa célula, o que permite:

● O uso de mostras conxeladas e non só limitado a mostras frescas

● Baixo estrés das células conxeladas en comparación co tratamento encimático das células frescas, o que se reflicte nos datos do transcriptoma en forma de menos xenes inducidos por estrés

● Non é necesario extraer previamente os glóbulos vermellos

● Diámetro celular ilimitado

● Gran variedade de mostras aptas para a análise, incluídos tipos de tecidos complexos e fráxiles que son propensos á agrupación ou destrución celular durante a disociación dos tecidos

Mostras que non se poden analizar mediante secuenciación de ARN unicelular e que son elixibles para a secuenciación de ARN de núcleo único:

Célula/Tecido	Razón
Desconxelar tecido conxelado	Non se poden obter organizacións recentes ou gardadas desde hai tempo
Célula muscular, megacariocito, graxa…	O diámetro da cela é demasiado grande para entrar no instrumento
Fígado…	Demasiado fráxil para romper, incapaz de distinguir células individuais
Célula neuronal, cerebro…	Máis sensible, fácil de estresar, cambiará os resultados da secuenciación
Páncreas, tiroide…	Rico en encimas endóxenos, que afectan á produción de suspensións unicelulares

Núcleo único vs. célula única

Núcleo único	Unicelular
Diámetro celular ilimitado	Diámetro celular: 10-40 μm
O material pode ser tecido conxelado	O material debe ser tecido fresco
Baixo estrés das células conxeladas	O tratamento encimático pode causar unha reacción de estrés celular
Non é necesario extraer glóbulos vermellos	É preciso eliminar os glóbulos vermellos
A bioinformación nuclear expresa a bioinformación	Toda a célula expresa bioinformación

Especificacións

Requisitos da mostra

Biblioteca

Estratexia de secuenciación

Datos recomendados

Control de calidade

Tecido animal ≥ 200 mg

Tecido vexetal ≥ 400 mg

Biblioteca de ADNc sn de 10x Genomics

Illumina PE150

100.000 lecturas de PE por cela

(100-200 Gb)

700-1200 núcleos/μl e integridade dos núcleos observada ao microscopio

Para obter máis detalles sobre a orientación para a preparación de mostras e o fluxo de traballo do servizo, non dubide en falar cunExperto en BMKGENE

Fluxo de traballo do servizo

Anterior: Secuenciación do xenoma completo de plantas/animais

Seguinte: Análise de asociación a nivel xenómico

Inclúe a seguinte análise:

● Control de calidade: número de células, detección de xenes, identificación precisa de células, moléculas de ARN e cuantificación da expresión

● Análise de mostras internas:

Agrupación celular e anotación de clústeres

Análise de expresión diferencial: identificación de DEG en clústeres

Anotación funcional e enriquecemento de DEGs de clúster

● Análise intergrupal:

Combinación de datos

Análise de expresión diferencial: identificación de DEG en grupos

Anotación funcional e enriquecemento de DEGs de grupo

● Análise avanzada:

Análise do ciclo celular

Análise de pseudotempo

Análise da comunicación celular (CellPhoneDB)

Análise de enriquecemento de conxuntos xénicos (GSEA)

Análise da mostra interna

Agrupación celular:

Análise de expresión diferencial: DEGs de clúster

Análise intergrupal

Análise de expresión diferencial: Grupo de DEGs

Análise avanzada:

Análise de pseudotempo:

Análise do ciclo celular:

Explora os avances facilitados polos servizos de secuenciación de ARN de núcleo único de BMKGene mediante 10X Chromium nestas publicacións destacadas:

Wang, L. et al. (2021) «A análise transcriptómica unicelular revela a paisaxe inmunitaria do pulmón na exacerbación da asma resistente aos esteroides».Actas da Academia Nacional de Ciencias dos Estados Unidos de América, 118(2), páx. e2005590118. doi: 10.1073/pnas.2005590118

Zheng, H. et al. (2022) «Unha rede reguladora global para a expresión xénica desregulada e a sinalización metabólica anormal en células inmunitarias no microambiente da enfermidade de Graves e a tiroidite de Hashimoto»,Fronteiras na inmunoloxía, 13, páx. 879824. doi: 10.3389/FIMMU.2022.879824/BIBTEX.

Tian, H. et al. (2023) «O transcriptoma unicelular descobre a heteroxeneidade e as respostas inmunitarias dos leucocitos despois da vacinación con Edwardsiella tarda inactivada no linguado (Paralichthys olivaceus)».Acuicultura, 566, páx. 739238. doi: 10.1016/J.AQUACULTURE.2023.739238.

Yu, Y. et al. (2023) «A terapia fotodinámica mellora o resultado dos inhibidores dos puntos de control inmunitario mediante a remodelación da inmunidade antitumoral en pacientes con cancro gástrico».Cancro gástrico, 26(5), páxs. 798–813. doi: 10.1007/S10120-023-01409-X/METRICS.