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एकल-नाभिकीय आरएनए अनुक्रमण
सिंगल-सेल कैप्चर और कस्टम लाइब्रेरी निर्माण तकनीकों के विकास, साथ ही हाई-थ्रूपुट सीक्वेंसिंग ने कोशिका स्तर पर जीन अभिव्यक्ति के अध्ययन में क्रांतिकारी बदलाव ला दिया है। इस अभूतपूर्व प्रगति से जटिल कोशिका समूहों का गहन और व्यापक विश्लेषण संभव हो पाता है, जिससे सभी कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति का औसत निकालने से जुड़ी सीमाएं दूर हो जाती हैं और इन समूहों के भीतर वास्तविक विविधता संरक्षित रहती है। हालांकि सिंगल-सेल आरएनए सीक्वेंसिंग (scRNA-seq) के निर्विवाद लाभ हैं, लेकिन कुछ ऊतकों में इसमें चुनौतियां आती हैं जहां सिंगल-सेल सस्पेंशन बनाना मुश्किल होता है और ताजे नमूनों की आवश्यकता होती है। BMKGene में, हम अत्याधुनिक 10X Genomics Chromium तकनीक का उपयोग करके सिंगल-न्यूक्लियस आरएनए सीक्वेंसिंग (snRNA-seq) की पेशकश करके इस बाधा का समाधान करते हैं। यह दृष्टिकोण सिंगल-सेल स्तर पर ट्रांसक्रिप्टोम विश्लेषण के लिए उपयुक्त नमूनों के स्पेक्ट्रम को व्यापक बनाता है।
नाभिकों का पृथक्करण 10X जीनोमिक्स क्रोमियम चिप की नवीन तकनीक के माध्यम से किया जाता है, जिसमें डबल क्रॉसिंग के साथ आठ-चैनल माइक्रोफ्लुइडिक्स प्रणाली मौजूद है। इस प्रणाली में, बारकोड, प्राइमर, एंजाइम और एक एकल नाभिक युक्त जेल बीड्स को नैनोलीटर आकार की तेल की बूंदों में समाहित किया जाता है, जिससे जेल बीड-इन-इमल्शन (GEM) बनता है। GEM बनने के बाद, प्रत्येक GEM के भीतर कोशिका का विघटन और बारकोड का विमोचन होता है। इसके बाद, mRNA अणु रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन द्वारा cDNAs में परिवर्तित हो जाते हैं, जिनमें 10X बारकोड और विशिष्ट आणविक पहचानकर्ता (UMI) समाहित होते हैं। फिर इन cDNAs का मानक अनुक्रमण लाइब्रेरी निर्माण किया जाता है, जिससे एकल-कोशिका स्तर पर जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल का व्यापक और गहन अध्ययन संभव हो पाता है।
प्लेटफ़ॉर्म: 10× जीनोमिक्स क्रोमियम और इलुमिना नोवासेक प्लेटफ़ॉर्म
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पूर्ण-लंबाई mRNA अनुक्रमण-नैनोपोर
जीन अभिव्यक्ति को मापने के लिए एनजीएस-आधारित एमआरएनए अनुक्रमण एक बहुमुखी उपकरण है, लेकिन इसकी छोटी रीड्स पर निर्भरता जटिल ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषणों में इसकी प्रभावशीलता को सीमित करती है। दूसरी ओर, नैनोपोर अनुक्रमण लंबी रीड तकनीक का उपयोग करता है, जिससे पूर्ण-लंबाई वाले एमआरएनए ट्रांसक्रिप्ट का अनुक्रमण संभव हो पाता है। यह दृष्टिकोण वैकल्पिक स्प्लिसिंग, जीन संलयन, पॉली-एडेनिलेशन और एमआरएनए आइसोफॉर्म के मात्रात्मक विश्लेषण की व्यापक खोज को सुगम बनाता है।
नैनोपोर अनुक्रमण, जो नैनोपोर एकल-अणु वास्तविक समय विद्युत संकेतों पर आधारित एक विधि है, वास्तविक समय में परिणाम प्रदान करती है। मोटर प्रोटीन द्वारा निर्देशित, दोहरे-स्ट्रैंड वाला डीएनए बायोफिल्म में अंतर्निहित नैनोपोर प्रोटीन से बंधता है, और वोल्टेज अंतर के तहत नैनोपोर चैनल से गुजरते समय खुलता है। डीएनए स्ट्रैंड पर विभिन्न बेस द्वारा उत्पन्न विशिष्ट विद्युत संकेतों का वास्तविक समय में पता लगाया और वर्गीकरण किया जाता है, जिससे सटीक और निरंतर न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमण में सहायता मिलती है। यह अभिनव दृष्टिकोण शॉर्ट-रीड की सीमाओं को दूर करता है और जटिल ट्रांसक्रिप्टोमिक अध्ययनों सहित जटिल जीनोमिक विश्लेषण के लिए तत्काल परिणामों के साथ एक गतिशील मंच प्रदान करता है।
प्लेटफ़ॉर्म: नैनोपोर प्रोमेथियन 48
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पूर्ण-लंबाई mRNA अनुक्रमण - PacBio
जीन अभिव्यक्ति को मापने के लिए NGS आधारित mRNA अनुक्रमण एक बहुमुखी उपकरण है, लेकिन इसकी छोटी रीड्स पर निर्भरता जटिल ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषणों में इसके उपयोग को सीमित करती है। दूसरी ओर, PacBio अनुक्रमण (Iso-Seq) लंबी रीड तकनीक का उपयोग करता है, जिससे पूर्ण-लंबाई वाले mRNA ट्रांसक्रिप्ट्स का अनुक्रमण संभव हो पाता है। यह दृष्टिकोण वैकल्पिक स्प्लिसिंग, जीन संलयन और पॉली-एडेनिलेशन के व्यापक अन्वेषण को सुगम बनाता है। हालांकि, आवश्यक डेटा की उच्च मात्रा के कारण जीन अभिव्यक्ति के मात्रात्मक मापन के लिए अन्य विकल्प भी उपलब्ध हैं। PacBio अनुक्रमण तकनीक एकल-अणु, वास्तविक समय (SMRT) अनुक्रमण पर आधारित है, जो पूर्ण-लंबाई वाले mRNA ट्रांसक्रिप्ट्स को कैप्चर करने में एक विशिष्ट लाभ प्रदान करती है। इस अभिनव दृष्टिकोण में जीरो-मोड वेवगाइड्स (ZMWs) और माइक्रोफैब्रिकेटेड वेल्स का उपयोग शामिल है जो अनुक्रमण के दौरान DNA पॉलीमरेज़ गतिविधि के वास्तविक समय अवलोकन को सक्षम बनाते हैं। इन ZMW के भीतर, PacBio का DNA पॉलीमरेज़ DNA का एक पूरक स्ट्रैंड संश्लेषित करता है, जिससे mRNA ट्रांसक्रिप्ट की संपूर्णता को कवर करने वाले लंबे रीड उत्पन्न होते हैं। सर्कुलर कंसेंसस सीक्वेंसिंग (CCS) मोड में PacBio का संचालन एक ही अणु को बार-बार सीक्वेंस करके सटीकता को बढ़ाता है। उत्पन्न हाई-फाई रीड की सटीकता NGS के बराबर होती है, जो जटिल ट्रांसक्रिप्टोमिक विशेषताओं के व्यापक और विश्वसनीय विश्लेषण में और योगदान देती है।
प्लेटफ़ॉर्म: पैकबियो सीक्वल II; पैकबियो रिवियो
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यूकेरियोटिक mRNA अनुक्रमण-NGS
mRNA सीक्वेंसिंग एक ऐसी तकनीक है जो अगली पीढ़ी की सीक्वेंसिंग का उपयोग करके जैविक नमूने में RNA अणुओं की उपस्थिति और मात्रा का पता लगाती है, जिससे नमूने में जीन अभिव्यक्ति का एक स्नैपशॉट मिलता है।
अपने व्यापक अनुप्रयोगों के साथ, यह अत्याधुनिक उपकरण विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं से जुड़े जटिल जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल, जीन संरचनाओं और आणविक तंत्रों को उजागर करता है।
इस तकनीक को अनुसंधान, नैदानिक निदान और दवा विकास में व्यापक रूप से अपनाया जाता है, क्योंकि यह कोशिकीय गतिशीलता और आनुवंशिक विनियमन की जटिलताओं में अंतर्दृष्टि प्रदान करती है, जिससे विभिन्न क्षेत्रों में इसकी क्षमता के बारे में जिज्ञासा जगाने के लिए एक ठोस आधार मिलता है।
उपलब्ध प्लेटफ़ॉर्म: इलुमिना नोवासेक एक्स; डीएनएसबीएसईक्यू-टी7
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नॉन-रेफरेंस आधारित mRNA सीक्वेंसिंग-NGS
mRNA अनुक्रमण विशिष्ट परिस्थितियों में कोशिकाओं के भीतर सभी mRNA प्रतिलेखों का व्यापक विश्लेषण करने में सक्षम बनाता है। यह अत्याधुनिक तकनीक जटिल जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल, जीन संरचनाओं और विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं से जुड़े आणविक तंत्रों को उजागर करने में एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में कार्य करती है। मौलिक अनुसंधान, नैदानिक निदान और औषधि विकास में व्यापक रूप से अपनाई जाने वाली mRNA अनुक्रमण, कोशिकीय गतिशीलता और आनुवंशिक विनियमन की जटिलताओं में अंतर्दृष्टि प्रदान करती है।
प्लेटफ़ॉर्म: इलुमिना नोवासेक एक्स; डीएनएसबीएसईक्यू-टी7
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लॉन्ग नॉन-कोडिंग सीक्वेंसिंग-इल्यूमिना
दीर्घ गैर-कोडिंग आरएनए (lncRNAs) 200 न्यूक्लियोटाइड से अधिक लंबे होते हैं, जिनमें न्यूनतम कोडिंग क्षमता होती है और ये गैर-कोडिंग आरएनए के महत्वपूर्ण तत्व हैं। केंद्रक और कोशिका द्रव्य में पाए जाने वाले ये आरएनए एपिजेनेटिक, ट्रांसक्रिप्शनल और पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, जो कोशिकीय और आणविक प्रक्रियाओं को आकार देने में उनके महत्व को रेखांकित करता है। lncRNA अनुक्रमण कोशिका विभेदन, ऑन्टोजेनेसिस और मानव रोगों के अध्ययन में एक शक्तिशाली उपकरण है।
प्लेटफ़ॉर्म: इलुमिना नोवासेक एक्स
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लघु आरएनए अनुक्रमण-इलुमिना
लघु आरएनए, आरएनए अणुओं का एक समूह है जिसमें माइक्रोआरएनए (miRNA), लघु इंटरफेयरिंग आरएनए (siRNA) और piwi-इंटरैक्टिंग आरएनए (piRNA) शामिल हैं। इनमें से, लगभग 18-25 न्यूक्लियोटाइड लंबे miRNA, विभिन्न कोशिकीय प्रक्रियाओं में अपनी महत्वपूर्ण नियामक भूमिकाओं के लिए विशेष रूप से उल्लेखनीय हैं। ऊतक-विशिष्ट और अवस्था-विशिष्ट अभिव्यक्ति पैटर्न के साथ, miRNA विभिन्न प्रजातियों में उच्च स्तर की समानता प्रदर्शित करते हैं।
प्लेटफ़ॉर्म: इलुमिना नोवासेक
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सर्क आरएनए अनुक्रमण-इलुमिना
वृत्ताकार आरएनए अनुक्रमण (circRNA-seq) वृत्ताकार आरएनए का प्रोफाइलिंग और विश्लेषण करता है। वृत्ताकार आरएनए अणुओं का एक वर्ग गैर-मानकीय स्प्लिसिंग घटनाओं के कारण बंद लूप बनाता है, जिससे इस आरएनए को अधिक स्थिरता मिलती है। जबकि कुछ circRNA को माइक्रोआरएनए स्पंज के रूप में कार्य करते हुए दिखाया गया है, जो माइक्रोआरएनए को अलग करते हैं और उन्हें उनके लक्षित एमआरएनए को विनियमित करने से रोकते हैं, वहीं अन्य circRNA प्रोटीन के साथ परस्पर क्रिया कर सकते हैं, जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित कर सकते हैं या कोशिकीय प्रक्रियाओं में भूमिका निभा सकते हैं। circRNA अभिव्यक्ति विश्लेषण इन अणुओं की नियामक भूमिकाओं और विभिन्न कोशिकीय प्रक्रियाओं, विकासीय चरणों और रोग स्थितियों में उनके महत्व की जानकारी प्रदान करता है, जिससे जीन अभिव्यक्ति के संदर्भ में आरएनए विनियमन की जटिलता की गहरी समझ में योगदान होता है।
प्लेटफ़ॉर्म: इलुमिना नोवासेक एक्स
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संपूर्ण ट्रांसक्रिप्टोम अनुक्रमण – इलुमिना
वोले ट्रांसक्रिप्टोम सीक्वेंसिंग, कोडिंग (mRNA) और नॉन-कोडिंग RNA (lncRNA, circRNA और miRNA) सहित विभिन्न RNA अणुओं की व्यापक प्रोफाइलिंग के लिए एक संपूर्ण दृष्टिकोण प्रदान करती है। यह तकनीक किसी विशिष्ट कोशिका के संपूर्ण ट्रांसक्रिप्टोम को एक निश्चित समय पर कैप्चर करती है, जिससे कोशिकीय प्रक्रियाओं की समग्र समझ प्राप्त होती है।
उपलब्ध प्लेटफ़ॉर्म: इलुमिना नोवासेक एक्स
