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एकल-नाभिकीय आरएनए अनुक्रमण

सिंगल-सेल कैप्चर और कस्टम लाइब्रेरी निर्माण तकनीकों के विकास, साथ ही हाई-थ्रूपुट सीक्वेंसिंग ने कोशिका स्तर पर जीन अभिव्यक्ति के अध्ययन में क्रांतिकारी बदलाव ला दिया है। इस अभूतपूर्व प्रगति से जटिल कोशिका समूहों का गहन और व्यापक विश्लेषण संभव हो पाता है, जिससे सभी कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति का औसत निकालने से जुड़ी सीमाएं दूर हो जाती हैं और इन समूहों के भीतर वास्तविक विविधता संरक्षित रहती है। हालांकि सिंगल-सेल आरएनए सीक्वेंसिंग (scRNA-seq) के निर्विवाद लाभ हैं, लेकिन कुछ ऊतकों में इसमें चुनौतियां आती हैं जहां सिंगल-सेल सस्पेंशन बनाना मुश्किल होता है और ताजे नमूनों की आवश्यकता होती है। BMKGene में, हम अत्याधुनिक 10X Genomics Chromium तकनीक का उपयोग करके सिंगल-न्यूक्लियस आरएनए सीक्वेंसिंग (snRNA-seq) की पेशकश करके इस बाधा का समाधान करते हैं। यह दृष्टिकोण सिंगल-सेल स्तर पर ट्रांसक्रिप्टोम विश्लेषण के लिए उपयुक्त नमूनों के स्पेक्ट्रम को व्यापक बनाता है।

नाभिकों का पृथक्करण 10X जीनोमिक्स क्रोमियम चिप की नवीन तकनीक के माध्यम से किया जाता है, जिसमें डबल क्रॉसिंग के साथ आठ-चैनल माइक्रोफ्लुइडिक्स प्रणाली मौजूद है। इस प्रणाली में, बारकोड, प्राइमर, एंजाइम और एक एकल नाभिक युक्त जेल बीड्स को नैनोलीटर आकार की तेल की बूंदों में समाहित किया जाता है, जिससे जेल बीड-इन-इमल्शन (GEM) बनता है। GEM बनने के बाद, प्रत्येक GEM के भीतर कोशिका का विघटन और बारकोड का विमोचन होता है। इसके बाद, mRNA अणु रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन द्वारा cDNAs में परिवर्तित हो जाते हैं, जिनमें 10X बारकोड और विशिष्ट आणविक पहचानकर्ता (UMI) समाहित होते हैं। फिर इन cDNAs का मानक अनुक्रमण लाइब्रेरी निर्माण किया जाता है, जिससे एकल-कोशिका स्तर पर जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल का व्यापक और गहन अध्ययन संभव हो पाता है।

प्लेटफ़ॉर्म: 10× जीनोमिक्स क्रोमियम और इलुमिना नोवासेक प्लेटफ़ॉर्म

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सेवा विवरण

बायोइनफॉरमैटिक्स

डेमो परिणाम

विशेष प्रकाशन

तकनीकी योजना

नाभिकों का पृथक्करण 10× जीनोमिक्स क्रोमियम™ द्वारा किया जाता है, जिसमें डबल क्रॉसिंग के साथ आठ-चैनल माइक्रोफ्लुइडिक्स सिस्टम होता है। इस सिस्टम में, बारकोड और प्राइमर, एंजाइम और एक एकल नाभिक वाले जेल बीड्स को नैनोलीटर आकार की तेल की बूंद में समाहित किया जाता है, जिससे जेल बीड-इन-इमल्शन (GEM) बनता है। GEM बनने के बाद, प्रत्येक GEM में कोशिका लिसिस और बारकोड की मुक्ति की प्रक्रिया की जाती है। mRNA को 10× बारकोड और UMI युक्त cDNA अणुओं में रिवर्स ट्रांसक्राइब किया जाता है, जिन्हें आगे मानक अनुक्रमण लाइब्रेरी निर्माण के लिए उपयोग किया जाता है।

विशेषताएँ

● जमे हुए ऊतकों से एकल-नाभिकीय निलंबन की तैयारी

● जेल बीड-इन-इमल्शन (जीईएम) का निर्माण और उसके बाद सीडीएनए संश्लेषण

● GEM में प्रत्येक मनका 4 खंडों से बने प्राइमर से भरा होता है:

mRNA प्राइमिंग और cDNA संश्लेषण के लिए पॉली(dT) टेल,

प्रवर्धन पूर्वाग्रह को ठीक करने के लिए विशिष्ट आणविक पहचानकर्ता (यूएमआई)

10x बारकोड

आंशिक रीड 1 अनुक्रमण प्राइमर का बंधन अनुक्रम

लाभ

एकल-नाभिकीय आरएनए अनुक्रमण एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण की सीमाओं को दूर करता है, जिससे निम्नलिखित संभव हो पाता है:

● जमे हुए नमूनों का उपयोग केवल ताजे नमूनों तक ही सीमित नहीं है।

● ताजे कोशिकाओं के एंजाइमेटिक उपचार की तुलना में जमे हुए कोशिकाओं में तनाव का स्तर कम होता है, जो ट्रांसक्रिप्टोम डेटा में कम तनाव-प्रेरित जीनों के रूप में परिलक्षित होता है।

● लाल रक्त कोशिकाओं को पहले से निकालने की आवश्यकता नहीं है

● असीमित सेल व्यास

● विश्लेषण के लिए योग्य नमूनों की एक विस्तृत श्रृंखला उपलब्ध है, जिसमें जटिल और नाजुक ऊतक प्रकार भी शामिल हैं जो ऊतक विखंडन के दौरान कोशिका गुच्छे बनने या नष्ट होने की संभावना रखते हैं।

वे नमूने जिनका विश्लेषण एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण द्वारा नहीं किया जा सकता है और जो एकल नाभिकीय आरएनए अनुक्रमण के लिए पात्र हैं:

कोशिका / ऊतक	कारण
बासी जमे हुए ऊतक	नए या लंबे समय से सहेजे गए संगठनों को प्राप्त करने में असमर्थ
मांसपेशी कोशिका, मेगाकारियोसाइट, वसा कोशिका…	कोशिका का व्यास इतना बड़ा है कि वह उपकरण में प्रवेश नहीं कर सकती।
जिगर…	टूटने के लिए बहुत नाजुक, एकल कोशिकाओं में अंतर करने में असमर्थ
न्यूरॉन कोशिका, मस्तिष्क…	अधिक संवेदनशील, आसानी से तनावग्रस्त होने वाला, अनुक्रमण परिणामों को बदल देगा।
अग्न्याशय, थायरॉइड...	अंतर्जात एंजाइमों से भरपूर, जो एकल कोशिका निलंबन के उत्पादन को प्रभावित करते हैं।

एकल-नाभिक बनाम एकल-कोशिका

एकल-नाभिक	एकल-कोशिका
असीमित कोशिका व्यास	कोशिका का व्यास: 10-40 माइक्रोमीटर
यह सामग्री जमे हुए ऊतक हो सकती है।	सामग्री ताजा ऊतक होनी चाहिए
जमे हुए कोशिकाओं का कम तनाव	एंजाइम उपचार से कोशिका तनाव प्रतिक्रिया हो सकती है।
लाल रक्त कोशिकाओं को निकालने की आवश्यकता नहीं है।	लाल रक्त कोशिकाओं को हटाने की आवश्यकता है
नाभिकीय अभिव्यक्ति जैव सूचना	पूरी कोशिका जैवसूचना व्यक्त करती है

विशेष विवरण

नमूना आवश्यकताएँ

पुस्तकालय

अनुक्रमण रणनीति

डेटा की अनुशंसा की गई

गुणवत्ता नियंत्रण

पशु ऊतक ≥ 200 मिलीग्राम

पौधे के ऊतक ≥ 400 मिलीग्राम

10x जीनोमिक्स एसएन सीडीएनए लाइब्रेरी

इलुमिना PE150

प्रति सेल 100K PE रीड्स

(100-200 जीबी)

सूक्ष्मदर्शी के नीचे 700-1200 नाभिक/μl और नाभिकीय अखंडता देखी गई।

नमूना तैयार करने संबंधी मार्गदर्शन और सेवा कार्यप्रणाली के बारे में अधिक जानकारी के लिए, कृपया किसी विशेषज्ञ से बात करने में संकोच न करें।बीएमकेजीन विशेषज्ञ

सेवा कार्य प्रवाह

पहले का: पादप/पशु संपूर्ण जीनोम अनुक्रमण

अगला: जीनोम-व्यापी एसोसिएशन विश्लेषण

इसमें निम्नलिखित विश्लेषण शामिल है:

● गुणवत्ता नियंत्रण: कोशिकाओं की संख्या, जीन का पता लगाना, कोशिकाओं, आरएनए अणुओं और अभिव्यक्ति की मात्रा का सटीक निर्धारण

● आंतरिक नमूना विश्लेषण:

सेल क्लस्टरिंग और क्लस्टर एनोटेशन

विभेदक अभिव्यक्ति विश्लेषण: समूहों में डीईजी की पहचान

क्लस्टर डीईजी का कार्यात्मक एनोटेशन और संवर्धन

● अंतर-समूह विश्लेषण:

डेटा का संयोजन

विभेदक अभिव्यक्ति विश्लेषण: समूहों में डीईजी की पहचान

समूह डीईजी का कार्यात्मक एनोटेशन और संवर्धन

● उन्नत विश्लेषण:

कोशिका चक्र विश्लेषण

छद्म समय विश्लेषण

सेल संचार विश्लेषण (CellPhoneDB)

जीन सेट संवर्धन विश्लेषण (जीएसईए)

आंतरिक-नमूना विश्लेषण

कोशिका समूहीकरण:

विभेदक अभिव्यक्ति विश्लेषण: क्लस्टर डीईजी

अंतर-समूह विश्लेषण

विभेदक अभिव्यक्ति विश्लेषण: समूह डीईजी

उन्नत विश्लेषण:

छद्म समय विश्लेषण:

कोशिका चक्र विश्लेषण:

इन चुनिंदा प्रकाशनों में 10X क्रोमियम द्वारा बीएमकेजीन की एकल-नाभिकीय आरएनए अनुक्रमण सेवाओं के माध्यम से सुगम बनाई गई प्रगति का अन्वेषण करें:

वांग, एल. एट अल. (2021) 'स्टेरॉयड-प्रतिरोधी अस्थमा के बढ़ने में फेफड़ों के प्रतिरक्षा परिदृश्य का एकल-कोशिका ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण से पता चलता है',संयुक्त राज्य अमेरिका की राष्ट्रीय विज्ञान अकादमी की कार्यवाही, 118(2), पृ. e2005590118. doi: 10.1073/pnas.2005590118

ज़ेंग, एच. एट अल. (2022) 'ग्रेव्स रोग और हाशिमोटो थायरॉइडिटिस के सूक्ष्म वातावरण में प्रतिरक्षा कोशिकाओं में अनियमित जीन अभिव्यक्ति और असामान्य चयापचय संकेत के लिए एक वैश्विक नियामक नेटवर्क',प्रतिरक्षा विज्ञान में सीमांत, 13, पृ. 879824. डीओआई: 10.3389/फिम्मू.2022.879824/बीआईबीटीएक्स।

तियान, एच. एट अल. (2023) 'एकल-कोशिका ट्रांसक्रिप्टोम फ्लॉन्डर (पैरालिचथिस ओलिवेसियस) में निष्क्रिय एडवर्डसिएला टार्डा के साथ टीकाकरण के बाद ल्यूकोसाइट्स की विषमता और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का खुलासा करता है',एक्वाकल्चर, 566, पृ. 739238. doi: 10.1016/J.AQUACULTURE.2023.739238.

यू, वाई. एट अल. (2023) 'फोटोडायनामिक थेरेपी गैस्ट्रिक कैंसर के रोगियों में एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा को रीमॉडेलिंग करके इम्यून चेकपॉइंट इनहिबिटर के परिणाम में सुधार करती है',पेट का कैंसर, 26(5), पृ. 798–813. doi: 10.1007/S10120-023-01409-X/METRICS.