Átírás
természet
KOMMUNIKÁCIÓK
Az SF3B1 mutáció teljes hosszúságú transzkriptum jellemzése krónikus limfocitás leukémiában a megtartott intronok leszabályozását mutatja
Teljes terjedelmű átiratok|Nanopórus szekvenálás|Alternatív izoformanalízis
Háttér
SAz SF3B1 splicing faktor omatikus mutációiról széles körben beszámoltak arról, hogy különféle rákos megbetegedésekhez kapcsolódnak, beleértve a krónikus limfocitás leukémiát (CLL), az uvealis melanomát, az emlőrákot stb. Ezen túlmenően, a rövid leolvasású transzkriptomikai vizsgálatok az SF3B1 mutációk által kiváltott rendellenes illesztési mintákat tártak fel.Azonban ezekkel az alternatív splicing mintákkal kapcsolatos tanulmányok sokáig csak eseményszintre korlátozódnak, és az izoforma szintű ismeretek hiánya miatt a rövid olvasásra összeállított átiratok korlátozottak.Itt bevezették a nanopórusos szekvenáló platformot a teljes hosszúságú átiratok előállításához, amely lehetővé tette az AS izoformák vizsgálatát.
Kísérleti terv
Kísérletek
Csoportosítás:1. CLL-SF3B1(WT) 2. CLL-SF3B1 (K700E mutáció);3. Normál B-sejtek
Szekvenálási stratégia:MinION 2D könyvtár szekvenálás, PromethION 1D könyvtár szekvenálás;röviden leolvasható adatok ugyanazon mintákból
Sorrendező platform:ONT MinION;ONT PromethION;
Bioinformatikai elemzés
Eredmények
Aösszesen 257 millió leolvasást generáltak 6 CLL-mintából és 3 B-sejtből.Ezeknek az olvasmányoknak átlagosan 30,5%-át teljes hosszúságú átiratként azonosították.
FAz RNS ull-long alternatív izoforma-analízisét (FLAIR) fejlesztették ki, hogy nagy megbízhatóságú izoformákat állítsanak elő.A FLAIR így foglalható össze:
Naz anopore read alignment: azonosítja az általános transzkript struktúrát a referencia genom alapján;
Splice junction korrekció: a szekvenciahibák (piros) kijavítása a splice helyekkel annotált intronokból, intronokból a rövid leolvasási adatokból vagy mindkettőből;
Collapse: összefoglalja a reprezentatív izoformákat a splice junction láncok alapján (első lépéses készlet).Válassza ki a nagy megbízhatóságú isofrom-ot a támogató leolvasások száma alapján (Küszöb: 3).
1. ábra: FLAIR-elemzés az SF3B1 mutációval kapcsolatos teljes izoformák azonosítására CLL-ben
FA LAIR 326 699 nagy megbízhatóságú összeillesztett izoformát azonosított, amelyek 90%-a új izoforma.A legtöbb ilyen megjegyzés nélküli izoforma ismert splice csomópontok új kombinációja (142 971), míg a többi új izoforma vagy megtartott intront (21 700) vagy új exont (3594) tartalmazott.
LAz ong-read szekvenciák lehetővé teszik a mutáns SF3B1-K700E-módosított illesztési helyek izoforma szintű azonosítását.35 alternatív 3'SS és 10 alternatív 5'SS szignifikánsan eltérő illesztést találtak az SF3B1-K700E és az SF3B1-WT között.A 35 elváltozás közül 33-at újonnan fedeztek fel régóta olvasott szekvenciák.A Nanopore adatok szerint az SF3B1-K700E által módosított 3'SS-ek és a kanonikus helyek csúcsai közötti távolság megoszlása -20 bp körül van, ami jelentősen eltér a kontrolleloszlástól, hasonlóan ahhoz, amit a CLL rövid leolvasási szekvenciáiban közöltek.Az ERGIC3 gén izoformáit elemeztük, ahol a proximális illesztési helyet tartalmazó új izoformát nagyobb mennyiségben találtuk az SF3B1-K700E-ben.Mind a proximális, mind a disztális 3'SS megkülönböztetett AS-mintázatokkal társult, amelyek több izoformát generáltak.
2. ábra. Alternatív 3′-es illesztési minták nanopórusos szekvenálási adatokkal azonosítva
Az IR eseményhasználat elemzése sokáig korlátozott volt a rövid leolvasáson alapuló elemzésben, az IR azonosításban és számszerűsítésben való bizalom miatt.Az SF3B1-K700E és SF3B1-WT IR izoformáinak expresszióját nanopórusos szekvenciák alapján számszerűsítettük, ami az SF3B1-K700E IR izoformáinak globális leszabályozását tárta fel.
4. ábra: Mezőgazdasági intenzitás és hálózati kapcsolat három gazdálkodási rendszerben (A és B);Véletlenszerű erdőelemzés (C) és kapcsolat a mezőgazdasági intenzitás és az AMF kolonizáció között (D)
3. ábra. Az intronkölcsönzési események erősebben leszabályozottak a CLL SF3B1-K700E-ben
Technológia
Nanopore Hosszú olvasott szekvenálás
NAz anopórus szekvenálás egyetlen molekula, valós idejű elektromos jel szekvenálási technológia.
DA kétszálú DNS vagy RNS a biofilmbe ágyazott nanopórusos fehérjéhez fog kötődni, és a motorfehérje vezetése alatt letekeredik.
DAz NA/RNS szálak a feszültségkülönbség hatására bizonyos sebességgel haladnak át a nanopóruscsatorna fehérjén.
Maz olekulák kémiai szerkezetüknek megfelelően különböző elektromos jeleket generálnak.
Ra sorozatok valós idejű észlelése bázishívással történik.
Teljes hosszúságú transzkriptum szekvenálás végrehajtása
√ Adattelítettség
Hétszer kevesebb olvasás szükséges a hasonló adattelítettség eléréséhez.
√ Átirati szerkezet azonosítása
Különféle szerkezeti változatok azonosítása az egyes átiratok konszenzusos teljes hosszúságú kiolvasásával
√ Átirat-szintű differenciálelemzés - A rövid leolvasások által elrejtett változások feltárása
Referencia
Tang AD, Soulette CM, Baren MJV és mások.Az SF3B1 mutáció teljes hosszúságú transzkriptum jellemzése krónikus limfocitás leukémiában a megtartott intronok csökkenését mutatja [J].Nature Communications.
Technika és kiemelések célja a különböző nagy áteresztőképességű szekvenálási technológiák legfrissebb sikeres alkalmazásainak megosztása a különböző kutatási színtereken, valamint a briliáns ötletek a kísérleti tervezés és adatbányászat terén.
Feladás időpontja: 2022-08-08