Egymagvú RNS-szekvenálás
Műszaki terv
A sejtmagok izolálását a 10× Genomics Chromium™ rendszerrel érik el, amely egy nyolccsatornás, kettős keresztezésű mikrofluidikai rendszerből áll. Ebben a rendszerben egy vonalkódokkal és primerrel ellátott gélgyöngyöt, enzimeket és egyetlen sejtmagot nanoliter méretű olajcseppbe kapszuláznak, így gélgyöngy-emulziót (GEM) hoznak létre. Miután a GEM-ek kialakultak, a sejtek lízise és a vonalkódok felszabadulása megtörténik minden egyes GEM-ben. Az mRNS-t reverz transzkripcióval írják át 10× vonalkóddal és UMI-val rendelkező cDNS molekulákká, amelyeket ezután standard szekvenálási könyvtár-konstrukciónak vetnek alá.
Jellemzők
● Egymagos szuszpenzió készítése fagyasztott szövetekből
● Gélgyöngy-emulzió (GEM) képződése, majd cDNS szintézis
● A GEM minden egyes gyöngyét 4 részből álló primerekkel töltik fel:
poli(dT) farok az mRNS priminghez és a cDNS szintézishez,
Egyedi molekuláris azonosító (UMI) az amplifikációs torzítás korrigálására
10x vonalkód
A részlegesen leolvasott 1 szekvenáló primer kötőszekvenciája
Előnyök
Az egymagvú RNS-szekvenálás megkerüli az egysejtű RNS-szekvenálás korlátait, lehetővé téve:
● Fagyasztott minták használata, nem csak friss mintákra korlátozódik
● A fagyasztott sejtek alacsonyabb stresszt mutatnak a friss sejtek enzimes kezeléséhez képest, ami a transzkriptom adatokban kevesebb stressz által indukált gén formájában tükröződik
● Nincs szükség a vörösvértestek előzetes eltávolítására
● Korlátlan cellaátmérő
● Széleskörű, elemzésre alkalmas minták, beleértve az összetett és törékeny szövettípusokat is, amelyek hajlamosak a sejtek összetapadására vagy pusztulására a szöveti disszociáció során
Olyan minták, amelyeket nem lehet egysejtű RNS-szekvenálással elemezni, de alkalmasak egymagvú RNS-szekvenálásra:
| Sejt / Szövet | Ok |
| Frissen fagyasztott szövet | Nem lehet friss vagy régóta mentett szervezeteket lekérni |
| Izomsejt, megakariocita, zsírsejt… | A cella átmérője túl nagy ahhoz, hogy bejusson a műszerbe |
| Máj… | Túl törékeny ahhoz, hogy eltörjön, nem képes megkülönböztetni az egyes sejteket |
| Neuronsejt, agy… | Érzékenyebb, könnyebben stresszelhető, megváltoztatja a szekvenálási eredményeket |
| Hasnyálmirigy, pajzsmirigy… | Gazdag endogén enzimekben, amelyek befolyásolják az egysejt-szuszpenziók termelését |
Egymagos vs. egysejtű
| Egymagos | Egysejtű |
| Korlátlan cellaátmérő | Sejtátmérő: 10-40 μm |
| Az anyag lehet fagyasztott szövet | Az anyagnak friss szövetnek kell lennie |
| A fagyasztott sejtek alacsony stresszszintje | Az enzimkezelés sejtes stresszreakciót okozhat |
| Nem kell vörösvértesteket eltávolítani | A vörösvértesteket el kell távolítani |
| A nukleáris bioinformációt fejez ki | Az egész sejt bioinformációt fejez ki |
Specifikációk
| Mintakövetelmények | Könyvtár | Szekvenálási stratégia | Ajánlott adatok | Minőségellenőrzés |
| Állati szövet ≥ 200 mg Növényi szövet ≥ 400 mg | 10x Genomics sn cDNA könyvtár | Illumina PE150 | 100 ezer PE leolvasás cellánként (100-200 GB) | 700-1200 sejtmag/μl és a sejtmagok integritásának mikroszkópos vizsgálata |
A minta előkészítésével és a szolgáltatási munkafolyamattal kapcsolatos további részletekért kérjük, forduljon bizalommal hozzánk.BMKGENE szakértő
Szolgáltatási munkafolyamat
A következő elemzést tartalmazza:
● Minőségellenőrzés: sejtek száma, géndetektálás, sejtek pontos azonosítása, RNS-molekulák és expresszió kvantifikálása
● Belső minta elemzése:
Cellacsoportosítás és klaszter-annotáció
Differenciális expressziós analízis: a differenciális gének (DEG-ek) azonosítása klaszterekben
A klaszter DEG-ek funkcionális annotációja és gazdagítása
● Csoportok közötti elemzés:
Adatok kombinációja
Differenciális expressziós analízis: a differenciális géneket (DEG-eket) csoportokban azonosítjuk
A csoportos differenciálódási gének funkcionális annotációja és gazdagítása
● Speciális elemzés:
Sejtciklus-elemzés
Pszeudoidő elemzés
Mobil kommunikációs elemzés (CellPhoneDB)
Génkészlet-dúsítási elemzés (GSEA)
Belső minta elemzése
Sejtcsoportosítás:
Differenciális expressziós analízis: klaszter DEG-ek
Csoportok közötti elemzés
Differenciális expressziós analízis: Csoportos DEG-ek
Speciális elemzés:
Pszeudoidő elemzés:
Sejtciklus-elemzés:
Fedezze fel a BMKGene egymagvú RNS szekvenálási szolgáltatásai által a 10X Chromium segítségével lehetővé tett fejlesztéseket ezekben a kiemelt kiadványokban:
Wang, L. és munkatársai (2021) „Egysejtű transzkriptomikai analízis feltárja a tüdő immunrendszerének jellegzetességeit szteroidrezisztens asztma exacerbáció esetén”,Az Amerikai Egyesült Államok Nemzeti Tudományos Akadémiájának folyóirata, 118(2). sz., e2005590118. doi: 10.1073/pnas.2005590118
Zheng, H. és munkatársai (2022) „Globális szabályozó hálózat a szabályozatlan génexpresszió és az abnormális metabolikus jelátvitel számára immunsejtekben a Graves-kór és a Hashimoto-pajzsmirigy-gyulladás mikrokörnyezetében”,Az immunológia határterületei, 13. o. 879824. doi: 10.3389/FIMMU.2022.879824/BIBTEX.
Tian, H. és munkatársai (2023) „Egysejtű transzkriptom feltárja a leukociták heterogenitását és immunválaszát inaktivált Edwardsiella tarda baktériummal történő vakcinázás után lepényhalban (Paralichthys olivaceus)”,Akvakultúra, 566, 739238. o. doi: 10.1016/J.AQUACULTURE.2023.739238.
Yu, Y. és munkatársai (2023) „A fotodinamikus terápia javítja az immunellenőrzőpont-gátlók eredményét a gyomorrákos betegek daganatellenes immunitásának átalakításán keresztül”,Gyomorrák, 26(5). sz., 798–813. o. doi: 10.1007/S10120-023-01409-X/METRICS.
