TRANSKRIPTOMIK
alam
KOMUNIKASI
Karakterisasi transkrip lengkap mutasi SF3B1 pada leukemia limfositik kronis mengungkapkan penurunan regulasi intron yang tertahan
Transkrip lengkap |Urutan nanopori|Analisis isoform alternatif
Latar belakang
Smutasi omatik pada faktor penyambungan SF3B1 telah banyak dilaporkan berhubungan dengan berbagai jenis kanker, termasuk leukemia limfositik kronis (CLL), melanoma uveal, kanker payudara, dll. Selain itu, studi transkriptomik singkat telah mengungkapkan pola penyambungan menyimpang yang disebabkan oleh mutasi SF3B1.Namun, studi tentang pola penyambungan alternatif ini telah lama terbatas pada tingkat peristiwa dan kurangnya pengetahuan tentang tingkat isoform karena keterbatasan transkrip kumpulan bacaan pendek.Di sini, platform sequencing nanopore diperkenalkan untuk menghasilkan transkrip full-length, yang memberdayakan inverstigasi pada isoform AS.
Desain eksperimental
Eksperimen
Pengelompokan:1. CLL-SF3B1(WT) 2. CLL-SF3B1(mutasi K700E);3. Sel B normal
Strategi pengurutan:Urutan perpustakaan Minion 2D, urutan perpustakaan PromethION 1D;data baca singkat dari sampel yang sama
Platform pengurutan:Minion ONT;Promesion ONT;
Analisis Bioinformatika
Hasil
Atotal 257 juta pembacaan dihasilkan dari 6 sampel CLL dan 3 sel B.Rata-rata 30,5% dari bacaan ini diidentifikasi sebagai transkrip lengkap.
Fanalisis isoform alternatif panjang penuh RNA (FLAIR) dikembangkan untuk menghasilkan satu set isoform berkeyakinan tinggi.FLAIR dapat diringkas sebagai:
Nanopore membaca penyelarasan: mengidentifikasi struktur transkrip umum berdasarkan genom referensi;
Skoreksi persimpangan plice: memperbaiki kesalahan urutan (merah) dengan situs sambungan dari intron beranotasi, intron dari data bacaan pendek atau keduanya;
Collapse: merangkum isoform representatif berdasarkan rantai persimpangan sambungan (set lintasan pertama).Pilih isofrom berkeyakinan tinggi berdasarkan jumlah bacaan pendukung (Ambang Batas: 3).
Gambar 1. Analisis FLAIR untuk mengidentifikasi isoform full-lenth yang terkait dengan mutasi SF3B1 pada CLL
FLAIR Mengidentifikasi 326.699 isoform tersambung berkeyakinan tinggi, 90% di antaranya adalah isoform baru.Sebagian besar isoform yang tidak diberi catatan ini ditemukan merupakan kombinasi baru dari sambungan sambungan yang diketahui (142.971), sedangkan isoform baru lainnya berisi intron yang dipertahankan (21.700) atau ekson baru (3594).
Lurutan yang sedang dibaca memberdayakan identifikasi situs sambungan yang diubah SF3B1-K700E mutan pada tingkat isoform.35 alternatif 3'SS dan 10 alternatif 5'SS ditemukan memiliki sambungan yang berbeda secara signifikan antara SF3B1-K700E dan SF3B1-WT.33 dari 35 perubahan baru ditemukan melalui rangkaian yang telah lama dibaca.Dalam data Nanopore, distribusi jarak antara 3'SS yang diubah SF3B1-K700E ke puncak situs kanonik adalah sekitar -20 bp, yang berbeda secara signifikan dari distribusi kontrol, mirip dengan apa yang telah dilaporkan dalam urutan baca singkat CLL.Isoform gen ERGIC3 dianalisis, di mana isoform baru yang mengandung situs sambungan proksimal ditemukan lebih banyak di SF3B1-K700E.3'SS proksimal dan distal dikaitkan dengan pola AS berbeda yang menghasilkan banyak isoform.
Gambar 2. Pola penyambungan alternatif 3′ yang diidentifikasi dengan data sekuensing nanopore
Analisis penggunaan peristiwa IR telah lama terbatas pada analisis berbasis pembacaan singkat karena keyakinan pada identifikasi dan kuantifikasi IR.Ekspresi isoform IR di SF3B1-K700E dan SF3B1-WT dikuantifikasi berdasarkan urutan nanopori, mengungkapkan penurunan regulasi global isoform IR di SF3B1-K700E.
Gambar 4. Intensitas pertanian dan konektivitas jaringan di tiga sistem pertanian (A dan B);Analisis acak hutan (C) dan Hubungan antara intensitas pertanian dan kolonisasi AMF (D)
Gambar 3. Peristiwa penyewaan intron diturunkan regulasinya secara lebih kuat di CLL SF3B1-K700E
Teknologi
Urutan Baca Panjang Nanopore
Npengurutan anopore adalah teknologi pengurutan sinyal listrik real-time molekul tunggal.
DDNA atau RNA beruntai ganda akan berikatan dengan protein berpori nano yang tertanam dalam biofilm dan terlepas di bawah kendali protein motorik.
DUntaian NA/RNA melewati protein saluran nanopori pada kecepatan tertentu di bawah pengaruh perbedaan tegangan.
Molekul menghasilkan sinyal listrik yang berbeda sesuai dengan struktur kimianya.
Rdeteksi urutan secara real-time dicapai dengan panggilan dasar.
Kinerja pengurutan transkriptom full-length
√ Saturasi Data
Diperlukan pembacaan 7 kali lipat lebih sedikit untuk mencapai saturasi data yang sebanding.
√ Identifikasi Struktur Transkrip
Identifikasi beragam varian struktural dengan konsensus pembacaan penuh setiap transkrip
√ Analisis diferensial tingkat transkrip -Mengungkapkan perubahan yang disembunyikan oleh bacaan singkat
Referensi
Tang AD, Soulette CM, Baren MJV, dkk.Karakterisasi transkrip lengkap mutasi SF3B1 pada leukemia limfositik kronis menunjukkan penurunan regulasi intron yang tertahan [J].Komunikasi Alam.
Teknologi dan Sorotan bertujuan untuk berbagi penerapan sukses terkini dari berbagai teknologi pengurutan throughput tinggi di berbagai arena penelitian serta ide-ide cemerlang dalam desain eksperimental dan penambangan data.
Waktu posting: 08 Januari 2022