Pengurutan RNA inti tunggal
Skema Teknis
Isolasi inti sel dicapai dengan 10× Genomics Chromium™, yang terdiri dari sistem mikrofluida delapan saluran dengan persilangan ganda. Dalam sistem ini, butiran gel dengan barcode dan primer, enzim, dan satu inti sel dikapsulasi dalam tetesan minyak berukuran nanoliter, menghasilkan Gel Bead-in-Emulsion (GEM). Setelah GEM terbentuk, lisis sel dan pelepasan barcode dilakukan di setiap GEM. mRNA ditranskripsi balik menjadi molekul cDNA dengan barcode 10× dan UMI, yang selanjutnya digunakan untuk pembuatan pustaka sekuensing standar.
Fitur
● Pembuatan suspensi inti tunggal dari jaringan beku
● Pembentukan Gel Bead-in-Emulsion (GEM) diikuti dengan sintesis cDNA
● Setiap manik dalam GEM diisi dengan primer yang terdiri dari 4 bagian:
Ekor poli(dT) untuk priming mRNA dan sintesis cDNA,
Pengidentifikasi Molekuler Unik (UMI) untuk mengoreksi bias amplifikasi
10x barcode
Urutan pengikatan primer pengurutan bacaan parsial 1
Keuntungan
Pengurutan RNA inti tunggal mengatasi keterbatasan pengurutan RNA sel tunggal, sehingga memungkinkan:
● Penggunaan sampel beku dan tidak hanya terbatas pada sampel segar
● Tingkat stres yang rendah pada sel beku dibandingkan dengan perlakuan enzimatik pada sel segar, tercermin dalam data transkriptom berupa gen yang kurang terinduksi stres.
● Tidak perlu melakukan pengeluaran sel darah merah terlebih dahulu
● Diameter sel tak terbatas
● Beragam sampel yang memenuhi syarat untuk dianalisis, termasuk jenis jaringan yang kompleks dan rapuh yang rentan terhadap penggumpalan atau kerusakan sel selama disosiasi jaringan.
Sampel yang tidak dapat dianalisis dengan sekuensing RNA sel tunggal dan memenuhi syarat untuk sekuensing RNA inti tunggal:
| Sel/Jaringan | Alasan |
| Jaringan beku yang tidak segar | Tidak dapat mengakses organisasi yang baru atau yang sudah lama tersimpan. |
| Sel otot, Megakariosit, Lemak… | Diameter sel terlalu besar untuk masuk ke dalam instrumen. |
| Hati… | Terlalu rapuh untuk dipatahkan, tidak mampu membedakan sel tunggal. |
| Sel neuron, Otak… | Lebih sensitif, mudah stres, akan mengubah hasil pengurutan. |
| Pankreas, Tiroid… | Kaya akan enzim endogen, yang memengaruhi produksi suspensi sel tunggal. |
Nukleus tunggal vs Sel tunggal
| Inti tunggal | Sel tunggal |
| Diameter sel tak terbatas | Diameter sel: 10-40 μm |
| Bahan tersebut bisa berupa jaringan beku. | Bahan tersebut harus berupa jaringan segar. |
| Tingkat stres rendah pada sel beku | Perawatan enzim dapat menyebabkan reaksi stres sel. |
| Tidak ada sel darah merah yang perlu dihilangkan. | Sel darah merah perlu dihilangkan. |
| Nuklir mengekspresikan bioinformasi | Seluruh sel mengekspresikan bioinformasi. |
Spesifikasi
| Contoh Persyaratan | Perpustakaan | Strategi pengurutan | Data yang direkomendasikan | Kontrol Kualitas |
| Jaringan hewan ≥ 200 mg Jaringan tanaman ≥ 400 mg | Pustaka cDNA sn 10x Genomics | Illumina PE150 | 100.000 pembacaan PE per sel (100-200 Gb) | 700-1200 inti/μl dan integritas inti diamati di bawah mikroskop. |
Untuk informasi lebih lanjut mengenai panduan persiapan sampel dan alur kerja layanan, silakan hubungi kami.Pakar BMKGENE
Alur Kerja Layanan
Termasuk analisis berikut:
● Kontrol Kualitas: jumlah sel, deteksi gen, identifikasi sel yang akurat, molekul RNA, dan kuantifikasi ekspresi.
● Analisis Sampel Internal:
Pengelompokan sel dan anotasi kelompok
Analisis Ekspresi Diferensial: identifikasi DEG dalam klaster
Anotasi fungsional dan pengayaan DEG klaster
● Analisis Antar Kelompok:
Kombinasi data
Analisis Ekspresi Diferensial: identifikasi DEG dalam kelompok
Anotasi fungsional dan pengayaan DEG kelompok
● Analisis Lanjutan:
Analisis siklus sel
Analisis waktu semu
Analisis komunikasi seluler (CellPhoneDB)
Analisis Pengayaan Kumpulan Gen (GSEA)
Analisis dalam sampel
Pengelompokan sel:
Analisis Ekspresi Diferensial: klaster DEGs
Analisis antar kelompok
Analisis Ekspresi Diferensial: Kelompok DEG
Analisis Lanjutan:
Analisis waktu semu:
Analisis siklus sel:
Jelajahi kemajuan yang difasilitasi oleh layanan pengurutan RNA inti tunggal BMKGene dengan 10X Chromium dalam publikasi unggulan berikut:
Wang, L. dkk. (2021) 'Analisis transkriptomik sel tunggal mengungkapkan lanskap imun paru-paru pada eksaserbasi asma resisten steroid',Prosiding Akademi Ilmu Pengetahuan Nasional Amerika Serikat, 118(2), hal. e2005590118. doi: 10.1073/pnas.2005590118
Zheng, H. dkk. (2022) 'Jaringan Regulasi Global untuk Ekspresi Gen yang Tidak Teratur dan Sinyal Metabolik Abnormal pada Sel Imun di Lingkungan Mikro Penyakit Graves dan Tiroiditis Hashimoto',Batasan dalam Imunologi, 13, hal. 879824. doi: 10.3389/FIMMU.2022.879824/BIBTEX.
Tian, H. dkk. (2023) 'Transkriptom sel tunggal mengungkap heterogenitas dan respons imun leukosit setelah vaksinasi dengan Edwardsiella tarda yang dinonaktifkan pada ikan flounder (Paralichthys olivaceus)',Akuakultur, 566, hlm. 739238. doi: 10.1016/J.AQUACULTURE.2023.739238.
Yu, Y. dkk. (2023) 'Terapi fotodinamik meningkatkan hasil inhibitor checkpoint imun melalui penataan ulang imunitas anti-tumor pada pasien kanker lambung',Kanker Lambung, 26(5), hlm. 798–813. doi: 10.1007/S10120-023-01409-X/METRICS.
