Sequenziamento di mRNA basato su non riferimento-Illumina
Caratteristiche
● Indipendente da qualsiasi genoma di riferimento,
● I dati potrebbero essere utilizzati per analizzare la struttura e l'espressione delle trascrizioni
● Identificare i siti di ritaglio variabili
Vantaggi del servizio
● Consegna dei risultati basata su BMKCloud: i risultati vengono forniti come file di dati e report interattivo tramite la piattaforma BMKCloud, che consente la lettura intuitiva di risultati di analisi complesse e l'estrazione di dati personalizzata sulla base di analisi bioinformatiche standard.
● Servizi post-vendita: servizi post-vendita validi per 3 mesi dal completamento del progetto, inclusi follow-up dei progetti, risoluzione dei problemi, domande e risposte sui risultati, ecc.
Requisiti e consegna del campione
Requisiti del campione:
Nucleotidi:
| Concentrazione (ng/μl) | Quantità (μg) | Purezza | Integrità |
| ≥ 20 | ≥ 0,5 | DE260/280=1,7-2,5 DE260/230=0,5-2,5 Contaminazione limitata o assente di proteine o DNA mostrata sul gel. | Per gli impianti: RIN≥6,5; Per gli animali: RIN≥7,0; 5,0≥28S/18S≥1,0; elevazione della linea di base limitata o assente |
Tessuto: Peso (secco): ≥1 g
*Per tessuti di peso inferiore a 5 mg, si consiglia di inviare campioni di tessuto congelati istantaneamente (in azoto liquido).
Sospensione cellulare: conta cellulare = 3×107
*Si consiglia di spedire il lisato cellulare congelato.Nel caso in cui la cella conteggi inferiore a 5×105, si consiglia il congelamento rapido in azoto liquido.
Campioni di sangue:
PA×geneBloodRNATube;
6 ml di TRIzol e 2 ml di sangue (TRIzol:sangue=3:1)
Consegna del campione consigliata
Contenitore:
Provetta da centrifuga da 2 ml (la carta stagnola non è consigliata)
Etichettatura del campione: Gruppo+replica, ad esempio A1, A2, A3;B1, B2, B3... ...
Spedizione:
1. Ghiaccio secco: i campioni devono essere confezionati in sacchetti e sepolti nel ghiaccio secco.
2.Provette RNAstable: i campioni di RNA possono essere essiccati in provette di stabilizzazione dell'RNA (ad esempio RNAstable®) e spediti a temperatura ambiente.
Flusso di lavoro del servizio
Progettazione dell'esperimento
Consegna del campione
Estrazione dell'RNA
Costruzione della biblioteca
Sequenziamento
Analisi dei dati
Servizi post-vendita
Bioinformatica
1.mRNA(denovo) Principio di assemblaggio
Tramite Trinity, le letture vengono frammentate in parti più piccole, note come K-mer.Questi K-meri vengono quindi utilizzati come semi da estendere in elementi contigui e quindi componenti basati su sovrapposizioni contigue.Infine, qui è stato applicato De Bruijn per riconoscere le trascrizioni nei componenti.
mRNA (De novo) Panoramica di Trinity
2.Distribuzione dell'mRNA (de novo) del livello di espressione genica
RNA-Seq è in grado di ottenere una stima altamente sensibile dell'espressione genica.Normalmente, l'intervallo rilevabile dell'espressione delle trascrizioni FPKM varia da 10^-2 a 10^6
mRNA (De novo) Distribuzione della densità FPKM in ciascun campione
3. Analisi di arricchimento GO di mRNA (De novo) di DEG
Il database GO (Gene Ontology) è un sistema strutturato di annotazione biologica contenente un vocabolario standard delle funzioni dei geni e dei prodotti genici.Contiene più livelli, dove più basso è il livello, più specifiche sono le funzioni.
mRNA (De novo) Classificazione GO dei DEG di secondo livello
Caso BMK
Analisi del trascrittoma del metabolismo del saccarosio durante il rigonfiamento e lo sviluppo del bulbo nella cipolla (Allium cepa L.)
Pubblicato: frontiere della scienza vegetale，2016
Strategia di sequenziamento
Illumina HiSeq2500
Raccolta campioni
In questo studio è stata utilizzata la cultivar Utah Yellow Sweet Spain "Y1351".Il numero di campioni raccolti è stato
15° giorno dopo il rigonfiamento (DAS) del bulbo (2 cm di diametro e 3–4 g di peso), 30° DAS (5 cm di diametro e 100–110 g di peso) e circa 3 giorni dopo il 40° DAS (7 cm di diametro e 100–110 g di peso) 260–300 grammi).
Risultati chiave
1. nel diagramma di Venn, sono stati rilevati un totale di 146 GRADI in tutte e tre le coppie di stadi di sviluppo
2. Il "trasporto e metabolismo dei carboidrati" era rappresentato da soli 585 unigeni (cioè il 7% del COG annotato).
3. Gli Unigenes annotati con successo nel database GO sono stati classificati in tre categorie principali per le tre diverse fasi di sviluppo del bulbo.I più rappresentati nella categoria principale “processo biologico” erano il “processo metabolico”, seguito dal “processo cellulare”.Nella categoria principale della “funzione molecolare” le due categorie più rappresentate erano “legame” e “attività catalitica”.
 Istogramma della classificazione dei cluster di gruppi ortologhi (COG). |  Istogramma della classificazione dell'ontologia genetica (GO) per gli unigeni derivati da bulbi in tre fasi di sviluppo |
 Diagramma di Venn che mostra i geni espressi in modo differenziale in due fasi qualsiasi dello sviluppo del bulbo della cipolla |
Riferimento
Zhang C, Zhang H, Zhan Z, et al.Analisi del trascrittoma del metabolismo del saccarosio durante il rigonfiamento e lo sviluppo del bulbo nella cipolla (Allium cepa L.)[J].Frontiere nella scienza delle piante, 2016, 7:1425-.DOI: 10.3389/fpls.2016.01425
