רצף mRNA באורך מלא -PacBio
יתרונות השירות
● קריאה ישירה של מולקולת cDNA באורך מלא מקצה 3' עד קצה 5'
● רזולוציית רמת איזו במבנה רצף
● תמלילים בעלי דיוק ויושרה גבוהים
● תואם מאוד למין vaiours
● קיבולת רצף גדולה עם 4 פלטפורמות רצף PacBio Sequel II מצוידות
● בעל ניסיון רב עם למעלה מ-700 פרויקטים של ריצוף RNA מבוססי Pacbio
● אספקת תוצאות מבוססת BMKCloud: כריית נתונים מותאמת אישית זמינה בפלטפורמה.
● שירותים לאחר המכירה תקפים ל-3 חודשים עם סיום הפרויקט
מפרט שירות
פלטפורמה: PacBio Sequel II
ספריית רצף: ספריית mRNA מועשרת בפולי A
תפוקת נתונים מומלצת: 20 Gb/דגימה (תלוי במין)
FLNC（%）： ≥75%
*FLNC: תסריטים לא כימריים באורך מלא
ניתוח ביואינפורמטיקה
● עיבוד נתונים גולמיים
● זיהוי תמלול
● מבנה רצף
● כימות ביטוי
● הערת פונקציה
דרישות לדוגמא ומשלוח
דרישות לדוגמה:
נוקלאוטידים:
| ריכוז (ng/μl) | כמות (מיקרוגרם) | טוֹהַר | יושרה |
| ≥ 120 | ≥ 0.6 | OD260/280=1.7-2.5 OD260/230=0.5-2.5 זיהום מוגבל או ללא חלבון או DNA מוצג על ג'ל. | לצמחים: RIN≥7.5; לבעלי חיים: RIN≥8.0; 5.0≥ 28S/18S≥1.0; גובה בסיס מוגבל או ללא |
רקמה: משקל (יבש):≥1 גרם
*עבור רקמה קטנה מ-5 מ"ג, אנו ממליצים לשלוח דגימת רקמה קפואה (בחנקן נוזלי).
השעיה תא:ספירת תאים = 3×106- 1×107
*אנו ממליצים לשלוח lysate תאים קפואים.במקרה שהתא הזה קטן מ-5×105, מומלץ להקפיא בזק בחנקן נוזלי, שעדיף למיצוי מיקרו.
דגימות דם:נפח≥1 מ"ל
בַּקטֶרִיָה:מסה ≥ 1 גרם
משלוח לדוגמא מומלץ
מְכוֹלָה:
שפופרת צנטריפוגה 2 מ"ל (לא מומלץ נייר כסף)
תיוג לדוגמה: קבוצה+שכפל, למשל A1, A2, A3;B1, B2, B3... ...
מִשׁלוֹחַ:
1. קרח יבש: יש לארוז דגימות בשקיות ולקבור אותן בקרח יבש.
2. צינורות RNAstable: ניתן לייבש דגימות RNA בצינור ייצוב RNA (למשל RNAstable®) ולשלוח בטמפרטורת החדר.
זרימת עבודה בשירות
עיצוב ניסוי
משלוח לדוגמא
מיצוי RNA
בניית ספרייה
רצף
ניתוח נתונים
שירותים לאחר המכירה
1. FLNC חלוקת אורך
אורך קריאה לא-כימרית באורך מלא (FLNC) מציין את אורך ה-cDNA בבניית הספרייה.הפצת אורך FLNC היא אינדיקטור מכריע בהערכת איכות בניית הספרייה.
התפלגות אורך קריאת FLNC
2. חלוקת אורך אזור ORF מלאה
אנו משתמשים ב-TransDecoder כדי לחזות אזורי קידוד חלבונים ורצפי חומצות אמינו תואמים ליצירת ערכות אוגניניות, המכילות מידע תמליל מלא שאינו מיותר בכל הדגימות.
חלוקת אורך אזור ORF מלאה
ניתוח העשרה של מסלול 3.KEGG
ניתן לזהות תמלילים (DETs) המובעים בצורה דיפרנציאלית על ידי יישור נתוני רצף RNA מבוססי NGS על ערכות תמלול באורך מלא שנוצרו על ידי נתוני רצף PacBio.DETs אלה יכולים לעבד עוד יותר עבור ניתוחים תפקודיים שונים, למשל ניתוח העשרה של מסלול KEGG.
העשרה של מסלול DET KEGG - עלילת נקודות
תיק BMK
הדינמיקה ההתפתחותית של תעתיק גזע Populus
יצא לאור: יומן ביוטכנולוגיה צמחית, 2019
אסטרטגיית רצף:
אוסף דוגמאות:אזורי גזע: קודקוד, אינטרנוד ראשון (IN1), אינטרנוד שני (IN2), אינטרנוד שלישי (IN3), אינטרנוד (IN4) ואינטרנוד (IN5) מבית Nanlin895
רצף NGS:RNA של 15 פרטים נאסף כמדגם ביולוגי אחד.שלושה שכפולים ביולוגיים של כל נקודה עובדו עבור רצף NGS
רצף TGS:אזורי הגזע חולקו לשלושה אזורים, כלומר apex, IN1-IN3 ו-IN4-IN5.כל אזור עבר עיבוד עבור רצף PacBio עם ארבעה סוגים של ספריות: 0-1 kb, 1-2 kb, 2-3 kb ו-3-10 kb.
תוצאות מפתח
1. בסך הכל זוהו 87,150 תמלילים באורך מלא, שבהם זוהו 2081 איזופורמים חדשים ו-62058 איזופורמים חלופיים חדשים.
זוהו 2.1187 lncRNA ו-356 גני מיזוג.
3. מצמיחה ראשונית לצמיחה משנית, זוהו 15838 תעתיקים בעלי ביטוי דיפרנציאלי מ-995 גנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי.בכל ה-DEG, 1216 היו גורמי שעתוק, שרובם טרם דווחו.
ניתוח העשרה של GO חשף חשיבות של חלוקת תאים ותהליך הפחתת חמצון בצמיחה ראשונית ומשנית.
אירועי שחבור אלטרנטיביים ואיזופורמים שונים
ניתוח WGCNA על גורמי שעתוק
התייחסות
Chao Q, Gao ZF, Zhang D, et al.הדינמיקה ההתפתחותית של תעתיק גזע Populus.Plant Biotechnol J. 2019;17(1):206-219.doi:10.1111/pbi.12958
