ריצוף RNA חד-גרעיני
תוכנית טכנית
בידוד הגרעינים מושג באמצעות 10× Genomics Chromium™, המורכב ממערכת מיקרופלואידיקה בת שמונה ערוצים עם מעברים כפולים. במערכת זו, חרוזי ג'ל עם ברקודים ופריימר, אנזימים וגרעין יחיד ארוזים בטיפה בגודל ננוליטר של שמן, ויוצרים חרוז ג'ל בתחליב (GEM). לאחר יצירת ה-GEM, מתבצעים ליזיס תאים ושחרור ברקודים בכל GEM. mRNA עובר תעתוק הפוך למולקולות cDNA עם ברקודים של 10× ו-UMI, אשר עוברות גם הן בניית ספריית ריצוף סטנדרטית.
תכונות
● הכנת תרחיף גרעיני יחיד מרקמות קפואות
● יצירת חרוזי ג'ל בתחליב (GEM) ולאחר מכן סינתזת cDNA
● כל חרוז ב-GEM טעון בפריימרים המורכבים מ-4 חלקים:
זנב פולי(dT) לצורך תחילה של mRNA וסינתזת cDNA,
מזהה מולקולרי ייחודי (UMI) לתיקון הטיה בהגברה
ברקוד 10x
רצף קשירה של פריימר ריצוף קריאה חלקית 1
יתרונות
ריצוף RNA של גרעין בודד עוקף את המגבלות של ריצוף RNA של תא בודד, ומאפשר:
● השימוש בדגימות קפואות ולא רק בדגימות טריות
● עקה נמוכה של תאים קפואים בהשוואה לטיפול אנזימטי בתאים טריים, דבר המשתקף בנתוני הטרנסקריפטום בצורה של פחות גנים המושרים על ידי עקה
● אין צורך בהסרה מוקדמת של תאי דם אדומים
● קוטר תא בלתי מוגבל
● מערך גדול של דגימות המתאימות לניתוח, כולל סוגי רקמות מורכבים ושבירים הנוטים להתקבצות תאים או להרס במהלך פירוק הרקמות
דגימות שלא ניתן לנתח באמצעות ריצוף RNA של תא בודד והן מתאימות לריצוף RNA של גרעינים בודדים:
| תא / רקמה | לְנַמֵק |
| רקמה קפואה לא טרייה | לא ניתן להשיג ארגונים חדשים או ארגונים שנשמרו זמן רב |
| תא שריר, מגה-קריוציט, תא שומן… | קוטר התא גדול מדי מכדי להיכנס למכשיר |
| כָּבֵד… | שביר מדי לשבירה, לא מסוגל להבחין בין תאים בודדים |
| תא נוירון, מוח… | רגיש יותר, קל ללחץ, ישנה את תוצאות הריצוף |
| לבלב, בלוטת התריס… | עשיר באנזימים אנדוגניים, המשפיעים על ייצור תרחיף תא בודד |
גרעין יחיד לעומת תא בודד
| גרעין יחיד | תא בודד |
| קוטר תא בלתי מוגבל | קוטר תא: 10-40 מיקרומטר |
| החומר יכול להיות רקמה קפואה | החומר חייב להיות רקמה טרייה |
| לחץ נמוך של תאים קפואים | טיפול אנזימטי עלול לגרום לתגובת לחץ תאית |
| אין צורך להסיר תאי דם אדומים | יש צורך להסיר תאי דם אדומים |
| גרעיני מבטא ביואינפורמציה | התא כולו מבטא ביואינפורמציה |
מפרט טכני
| דרישות לדוגמה | סִפְרִיָה | אסטרטגיית ריצוף | נתונים מומלצים | בקרת איכות |
| רקמת בעלי חיים ≥ 200 מ"ג רקמת צמח ≥ 400 מ"ג | ספריית cDNA של 10x של גנומיקה sn | אילומינה PE150 | 100,000 קריאות PE לכל תא (100-200 ג'יגה-בייט) | 700-1200 גרעינים/μl ושלמות הגרעינים נצפו תחת מיקרוסקופ |
לפרטים נוספים על הנחיות להכנת דגימות וזרימת עבודה של השירות, אל תהססו לדבר עםמומחה BMKGENE
זרימת עבודה של שירות
כולל את הניתוח הבא:
● בקרת איכות: מספר תאים, גילוי גנים, זיהוי מדויק של תאים, מולקולות RNA וכימות ביטוי
● ניתוח דגימה פנימית:
קיבוץ תאים וביאור אשכולות
ניתוח ביטוי דיפרנציאלי: זיהוי של DEGs באשכולות
ביאור פונקציונלי והעשרה של DEGs אשכול
● ניתוח בין-קבוצתי:
שילוב נתונים
ניתוח ביטוי דיפרנציאלי: זיהוי של DEGs בקבוצות
ביאור פונקציונלי והעשרה של DEGs קבוצתיים
● ניתוח מתקדם:
ניתוח מחזור התא
ניתוח פסאודו-זמן
ניתוח תקשורת סלולרית (CellPhoneDB)
ניתוח העשרת מערכי גנים (GSEA)
ניתוח מדגם פנימי
קיבוץ תאים:
ניתוח ביטוי דיפרנציאלי: DEGs אשכול
ניתוח בין-קבוצתי
ניתוח ביטוי דיפרנציאלי: DEGs קבוצתיים
ניתוח מתקדם:
ניתוח פסאודו-זמן:
ניתוח מחזור התא:
גלו את ההתקדמות שמאפשרות שירותי ריצוף ה-RNA הבודד-גרעיני של BMKGene על ידי 10X Chromium בפרסומים המומלצים הבאים:
Wang, L. et al. (2021) 'ניתוח טרנסקריפטומי של תא בודד חושף את הנוף החיסוני של הריאה בהחמרה של אסתמה עמידה לסטרואידים',דיוני האקדמיה הלאומית למדעים של ארצות הברית של אמריקה, 118(2), עמ' e2005590118. doi: 10.1073/pnas.2005590118
ג'נג, ה. ואחרים (2022) 'רשת רגולטורית עולמית לביטוי גנים לא מווסת ואיתות מטבולי לא תקין בתאי מערכת החיסון בסביבה המיקרו של מחלת גרייבס ודלקת בלוטת התריס של השימוטו',גבולות באימונולוגיה, 13, עמ'. 879824. doi: 10.3389/FIMMU.2022.879824/BIBTEX.
טיאן, ה. ואחרים (2023) 'טרנסקריפטום של תא בודד חושף הטרוגניות ותגובות חיסוניות של לויקוציטים לאחר חיסון עם Edwardsiella tarda מומת בדגיגים (Paralichthys olivaceus)',חקלאות ימית, 566, עמ' 739238. doi: 10.1016/J.AQUACULTURE.2023.739238.
יו, י. ואחרים (2023) 'טיפול פוטודינמי משפר את התוצאה של מעכבי נקודות בקרה חיסוניות באמצעות עיצוב מחדש של חסינות אנטי-גידולית בחולים עם סרטן קיבה',סרטן הקיבה, 26(5), עמ' 798–813. doi: 10.1007/S10120-023-01409-X/METRICS.
