全長 mRNA シーケンス - ナノポア
サービスのメリット
● 低シーケンスバイアス
● 全長cDNA分子の解明
● 同じ数のトランスクリプトをカバーするのに必要なデータが少なくなる
● 遺伝子ごとの複数のアイソフォームの同定
● アイソフォームレベルでの発現定量化
サービス仕様
| 図書館 | プラットホーム | 推奨されるデータ収量 (Gb) | 品質管理 |
| cDNA-PCR(ポリA濃縮) | ナノポア プロメチオン P48 | 6 Gb/サンプル (種によって異なります) | 全長比＞70% 平均品質スコア: Q10
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バイオインフォマティクス分析
●生データの処理
● 転写物の識別
●交互接続
● 遺伝子レベルおよびアイソフォームレベルでの発現定量化
● 発現差解析
● 関数のアノテーションとエンリッチメント (DEG と DET)
サンプルの要件と納品
サンプル要件:
ヌクレオチド:
| 濃度(ng/μl) | 量（μg） | 純度 | 誠実さ |
| ≥ 100 | ≧ 0.6 | OD260/280=1.7-2.5 OD260/230=0.5～2.5 ゲル上にタンパク質や DNA の汚染はほとんど見られないか、まったく見られません。 | 植物の場合: RIN≥7.0。 動物の場合：RIN≧7.5。 5.0≧28S/18S≧1.0; 基準高度が限られているか、基準高度がない |
ティッシュ: 重量 (乾燥): ≥1 g
※5 mg未満の組織については、急速冷凍（液体窒素）した組織サンプルをお送りいただくことをお勧めします。
細胞懸濁液: 細胞数 = 3×106- 1×107
※細胞ライセートは凍結して発送することをお勧めします。セル数が5×10未満の場合5、液体窒素で急速冷凍することをお勧めします。これは微量抽出に適しています。
血液サンプル: 容量 ≥1 ml
推奨されるサンプル配信
容器: 2 ml 遠沈管 (錫箔は推奨しません)
ラベル付けのサンプル: グループ + 複製 (A1、A2、A3 など)。B1、B2、B3……
発送: 2、ドライアイス: サンプルは袋に詰めてドライアイスに埋める必要があります。
- RNAstable チューブ: RNA サンプルは RNA 安定化チューブ (例: RNAstable®) 内で乾燥され、室温で出荷されます。
サービスのワークフロー
ヌクレオチド:
サンプル納品
図書館の建設
シーケンス
データ分析
アフターサービス
サービスのワークフロー
組織：
実験計画
サンプル納品
RNA抽出
図書館の建設
シーケンス
データ分析
アフターサービス
1.微分発現解析 - ボルケーノプロット
発現差解析は、発現差のある遺伝子 (DEG) を識別する遺伝子レベルと、発現差を識別するアイソフォーム レベルの両方で処理できます。
発現転写産物 (DET)
2.階層的クラスタリングのヒートマップ
3.選択的スプライシングの識別と分類
Astalavista では 5 種類の選択的スプライシング イベントを予測できます。
4.ポリ A の 50 bp 上流における代替ポリアデニル化 (APA) イベントの同定とモチーフ
BMKケース
ナノポア全長トランスクリプトームシーケンシングによる選択的スプライシングの同定とアイソフォームレベルの定量化
公開日:ネイチャーコミュニケーションズ、2020
シーケンス戦略:
グループ化: 1. CLL-SF3B1(WT);2. CLL-SF3B1(K700E変異);3. 正常なB細胞
シーケンス戦略: MinION 2D ライブラリ シーケンス、PromethION 1D ライブラリ シーケンス。同じサンプルからのショートリードデータ
シーケンスプラットフォーム: Nanopore MinION;ナノポアプロメチオン;
主な結果
1.アイソフォームレベルの選択的スプライシングの同定
ロングリード配列により変異体 SF3B1 の同定が可能にK700E-アイソフォームレベルでのスプライス部位の変更。SF3B1 間では、35 個の代替 3'SS と 10 個の代替 5'SS が有意に異なってスプライシングされることが判明しました。K700EとSF3B1WT。35 個の変化のうち 33 個はロングリード配列によって新たに発見されました。
2.アイソフォームレベルの選択的スプライシングの定量化
SF3B1におけるイントロン保持(IR)アイソフォームの発現K700EとSF3B1WTナノポア配列に基づいて定量化され、SF3B1 における IR アイソフォームの全体的なダウンレギュレーションが明らかになりました。K700E.
参照
Tang AD、Soulette CM、Baren MJV 他慢性リンパ性白血病におけるSF3B1変異の全長転写産物の特徴付けにより、保持されたイントロンの下方制御が明らかになった[J]。ネイチャーコミュニケーションズ。
