Long non-coding sequencing-Illumina
Kaluwihan Service
● Kaluwihan Layanan
● Spesifik sel lan jaringan
● Tahap spesifik nuduhake lan nampilake owah-owahan ekspresi dinamis
● Pola ekspresi wektu lan papan sing tepat
● Analisis gabungan karo data mRNA.
● Pangiriman asil adhedhasar BMKCloud: Data-mining khusus kasedhiya ing platform.
● Layanan sawise-sale bener kanggo 3 sasi sawise project completion
Syarat Sampel lan Pangiriman
| Pustaka | Platform | Data sing disaranake | Data QC |
| kekurangan rRNA | Illumina PE 150 Kab | 10 Gb | Q30≥85% |
| Konk.(ng/μl) | Jumlah (μg) | Kemurnian | Integritas |
| ≥ 100 | ≥ 0,5 | OD260/280=1.7-2.5 OD260/230=0,5-2,5 Kontaminasi protein utawa DNA diwatesi utawa ora ditampilake ing gel. | Kanggo tetanduran: RIN≥6.5; Kanggo kewan: RIN≥7.0; 5.0≥28S/18S≥1.0; winates utawa ora elevasi baseline |
Nukleotida:
Tisu: Bobot (garing): ≥1 g
*Kanggo jaringan sing luwih cilik saka 5 mg, disaranake ngirim sampel jaringan flash beku (ing nitrogen cair).
Suspensi sel: Jumlah sel = 3×107
* Disaranake ngirim lysate sel beku.Yen jumlah sel luwih cilik tinimbang 5 × 105, lampu kilat beku ing nitrogen cair dianjurake.
Sampel getih:
PA×geneBloodRNATube;
6mLTRIzol lan 2mL getih (TRIzol:Getih=3:1)
Pangiriman Sampel sing Disaranake
Wadah: 2 ml tabung centrifuge (Timah foil ora dianjurake)
Labeling sampel: Group+replikat contone A1, A2, A3;B1, B2, B3....
Kintunan:
1.Es garing: Sampel kudu dikemas ing tas lan dikubur ing es garing.
2.Tabung stabil RNA: Sampel RNA bisa dikeringake ing tabung stabilisasi RNA (umpamane RNAstable®) lan dikirim ing suhu kamar.
Alur Kerja Layanan
Desain eksperimen
pangiriman sampel
Ekstraksi RNA
Konstruksi perpustakaan
Sequencing
Analisis data
Layanan sawise-sale
Bioinformatika
1. Klasifikasi LncRNA
LncRNA sing diprediksi dening papat piranti lunak ing ndhuwur diklasifikasikake dadi 4 kategori: lincRNA, anti-sense-LncRNA, intronic-LncRNA;rasa-LncRNA.Klasifikasi LncRNA ditampilake ing histogram ing ngisor iki.
Klasifikasi LncRNA
2.Cis-target gen analisis pengayaan DE-lncRNA
ClusterProfiler dipunginaaken wonten ing analisis pengayaan GO ing gen cis-target saka lncRNA (DE-lncRNA), ing syarat-syarat pangolahan biologi, fungsi molekul lan komponen seluler.Analisis pengayaan GO minangka proses kanggo ngenali istilah GO sing diarahake DEG kanthi signifikan dibandhingake karo kabeh genom.Istilah-istilah sing dianyari ditampilake ing histogram, grafik gelembung, lan liya-liyane kaya ing ngisor iki.
Gen sing ditargetake cis saka analisis pengayaan DE-lncRNA - Bagan gelembung
3. Kanthi mbandhingake dawa, nomer exon, ORF lan jumlah ekspresi mRNA lan lncRNA, kita bisa ngerti bedane struktur, urutan lan liya-liyane, lan uga verifikasi manawa lncRNA novel sing diprediksi kita cocog karo karakteristik umum.
Kasus BMK
Profil ekspresi lncRNA deregulasi ing adenokarsinoma paru-paru tikus kanthi mutasi KRAS-G12D lan kalah P53
Diterbitake:Jurnal Kedokteran Seluler lan Molekuler,2019
Strategi urutan
Illumina
Koleksi sampel
Sel NONMMUT015812-knockdown KP (shRNA-2) lan sel kontrol negatif (sh-Scr) dijupuk ing dina 6 infeksi virus tartamtu.
Asil kunci
Panaliten iki nyelidiki lncRNA sing diungkapake kanthi aberrant ing adenokarsinoma paru-paru tikus kanthi kalah P53 lan mutasi KrasG12D.
1.6424 lncRNAs dituduhake kanthi beda (≥ 2 kali owah-owahan, P <0.05).
2. Ing antarane kabeh 210 lncRNAs(FC≥8), 11 ekspresi lncRNAs diatur dening P53, 33 lncRNAs dening KRAS lan 13 lncRNAs dening hypoxia ing sel KP utami, mungguh.
3.NONMMUT015812, sing banget diatur ing adenokarsinoma paru-paru tikus lan diatur kanthi negatif dening ekspresi ulang P53, dideteksi kanggo nganalisa fungsi seluler.
4. Knockdown saka NONMMUT015812 dening shRNAs sudo proliferasi lan migrasi kabisan sel KP.NONMMUT015812 minangka onkogen potensial.
 Analisis jalur KEGG saka gen sing diungkapake kanthi beda ing sel KP NONMMUT015812-knockdown |  Analisis Ontologi Gen saka gen sing diekspresikake kanthi beda ing sel KP NONMMUT015812-knockdown |
Referensi
Profil ekspresi lncRNA deregulasi ing adenokarsinoma paru-paru tikus kanthi mutasi KRAS-G12D lan kalah P53 [J].Jurnal Kedokteran Seluler lan Molekuler, 2019, 23(10).DOI: 10.1111/jcmm.14584
