ტრანსკრიპტომიკა
ბუნება
კომუნიკაციები
ქრონიკულ ლიმფოციტურ ლეიკემიაში SF3B1 მუტაციის სრულმეტრაჟიანი ტრანსკრიპტის დახასიათება ავლენს შეკავებული ინტრონების დაქვეითებას
სრულმეტრაჟიანი ტრანსკრიპტები|ნანოფორების თანმიმდევრობა|ალტერნატიული იზოფორმული ანალიზი
ფონი
Sომატური მუტაციები სპლაისინგის ფაქტორში SF3B1 ფართოდ არის მოხსენებული, რომ ასოცირდება სხვადასხვა კიბოსთან, მათ შორის ქრონიკულ ლიმფოციტურ ლეიკემიასთან (CLL), უვეალური მელანომა, ძუძუს კიბო და ა.შ. გარდა ამისა, მოკლედ წაკითხული ტრანსკრიპტომიური კვლევები გამოავლინა SF3B1 მუტაციებით გამოწვეული აბერანტული შერწყმის ნიმუშები.თუმცა, შეჯვარების ამ ალტერნატიულ ნიმუშებზე კვლევები დიდი ხანია შემოიფარგლება მოვლენის დონეზე და იზოფორმის დონეზე ცოდნის ნაკლებობით, მოკლედ წაკითხული აწყობილი ტრანსკრიპტების შეზღუდვის გამო.აქ, ნანოფორების თანმიმდევრობის პლატფორმა დაინერგა სრულმეტრაჟიანი ტრანსკრიპტების გენერირებისთვის, რამაც გააძლიერა AS იზოფორმების გამოკვლევა.
Ექსპერიმენტული დიზაინი
ექსპერიმენტები
დაჯგუფება:1. CLL-SF3B1(WT) 2. CLL-SF3B1(K700E მუტაცია);3. ნორმალური B-უჯრედები
თანმიმდევრობის სტრატეგია:MinION 2D ბიბლიოთეკის თანმიმდევრობა, PromethION 1D ბიბლიოთეკის თანმიმდევრობა;მოკლედ წაკითხული მონაცემები იგივე ნიმუშებიდან
თანმიმდევრობის პლატფორმა:ONT MinION;ONT PromethION;
ბიოინფორმატიული ანალიზი
შედეგები
ასულ 257 მილიონი კითხვა იყო გენერირებული 6 CLL ნიმუშიდან და 3 B-უჯრედიდან.ამ წაკითხვის საშუალოდ 30.5% იდენტიფიცირებული იყო, როგორც სრულმეტრაჟიანი ტრანსკრიპტები.
Fრნმ-ის (FLAIR) ალტერნატიული ალტერნატიული იზოფორმული ანალიზი შეიქმნა მაღალი საიმედო იზოფორმების ნაკრების შესაქმნელად.FLAIR შეიძლება შეჯამდეს შემდეგნაირად:
Nanopore კითხულობს გასწორებას: ზოგადი ტრანსკრიპტის სტრუქტურის იდენტიფიცირება საცნობარო გენომის საფუძველზე;
Sპლისის შეერთების კორექტირება: შეასწორეთ თანმიმდევრობის შეცდომები (წითელი) შერწყმის ადგილით ანოტირებული ინტრონებიდან, ინტრონები მოკლე წაკითხული მონაცემებიდან ან ორივედან;
Cამოვარდნა: შეაჯამეთ წარმომადგენლობითი იზოფორმები, რომლებიც დაფუძნებულია შეერთების ჯაჭვებზე (პირველი გავლის ნაკრები).აირჩიეთ მაღალი ნდობის იზიდან, დამხმარე წაკითხვის რაოდენობის მიხედვით (ბარიერი: 3).
სურათი 1. FLAIR ანალიზი CLL-ში SF3B1 მუტაციასთან დაკავშირებული სრული სიგრძის იზოფორმების იდენტიფიცირებისთვის
FLAIR-მა გამოავლინა 326,699 მაღალი ნდობის შედუღებული იზოფორმები, რომელთაგან 90% ახალი იზოფორმებია.აღმოჩნდა, რომ ამ უანოტაციური იზოფორმების უმეტესობა იყო ცნობილი შერწყმის შეერთების ახალი კომბინაციები (142,971), ხოლო დანარჩენი ახალი იზოფორმები შეიცავდა ან შეკავებულ ინტრონს (21,700) ან ახალ ეგზონს (3594).
Lწაკითხული თანმიმდევრობები აძლიერებს მუტანტის SF3B1-K700E-შეცვლილი შერწყმის ადგილების იდენტიფიკაციას იზოფორმის დონეზე.აღმოჩნდა, რომ 35 ალტერნატიული 3'SS და 10 ალტერნატიული 5'SSs იყო მნიშვნელოვნად განსხვავებულად შერწყმული SF3B1-K700E და SF3B1-WT შორის.35 ცვლილებადან 33 ახლად იქნა აღმოჩენილი დიდი ხნის წაკითხული თანმიმდევრობით.Nanopore-ის მონაცემებში, SF3B1-K700E-შეცვლილ 3'SS-ებს შორის მანძილის განაწილება კანონიკურ უბნების მწვერვალებამდე არის დაახლოებით -20 bp, რაც მნიშვნელოვნად განსხვავდება საკონტროლო განაწილებისგან, რაც მოხსენებულია CLL მოკლე წაკითხვის თანმიმდევრობებში.გაანალიზდა ERGIC3 გენის იზოფორმები, სადაც ახალი იზოფორმი, რომელიც შეიცავს პროქსიმალურ შეჯვარების ადგილს, აღმოჩნდა უფრო უხვად SF3B1-K700E-ში.ორივე პროქსიმალური და დისტალური 3'SS ასოცირებული იყო განსხვავებულ AS შაბლონებთან, რომლებიც წარმოქმნიან მრავალ იზოფორმებს.
სურათი 2. ალტერნატიული 3′ შერწყმის ნიმუშები, რომლებიც იდენტიფიცირებულია ნანოფორების თანმიმდევრობის მონაცემებით
IR მოვლენის გამოყენების ანალიზი დიდი ხანია შეზღუდულია მოკლე წაკითხვაზე დაფუძნებულ ანალიზში IR იდენტიფიკაციისა და რაოდენობრივი ნდობის გამო.IR იზოფორმების გამოხატულება SF3B1-K700E-სა და SF3B1-WT-ში რაოდენობრივად შეფასდა ნანოპური თანმიმდევრობების საფუძველზე, რაც ავლენს IR იზოფორმების გლობალურ დაქვეითებას SF3B1-K700E-ში.
სურათი 4. სოფლის მეურნეობის ინტენსივობა და ქსელის კავშირი სამ ფერმერულ სისტემაში (A და B);შემთხვევითი ტყის ანალიზი (C) და კავშირი სოფლის მეურნეობის ინტენსივობასა და AMF კოლონიზაციას შორის (D)
სურათი 3. ინტრონის შეკავების მოვლენები უფრო მკაცრად დაქვეითებულია CLL SF3B1-K700E-ში
ტექნიკა
Nanopore დიდხანს წაკითხული თანმიმდევრობა
Nანოპორის თანმიმდევრობა არის ერთი მოლეკულის რეალურ დროში ელექტრული სიგნალის თანმიმდევრობის ტექნოლოგია.
Dორჯაჭვიანი დნმ ან რნმ დაუკავშირდება ნანოფოროვან ცილას, რომელიც ჩაშენებულია ბიოფილმში და იხსნება საავტომობილო ცილის ტყვიის ქვეშ.
DNA/RNA ძაფები გადის ნანოპორული არხის პროტეინს გარკვეული სიჩქარით ძაბვის სხვაობის მოქმედებით.
Mოლეკულები წარმოქმნიან სხვადასხვა ელექტრულ სიგნალებს ქიმიური სტრუქტურის მიხედვით.
Rთანმიმდევრობების რეალურ დროში გამოვლენა მიიღწევა ბაზის გამოძახებით.
სრულმეტრაჟიანი ტრანსკრიპტომის თანმიმდევრობის შესრულება
√ მონაცემთა გაჯერება
7-ჯერ ნაკლები წაკითხვაა საჭირო მონაცემთა შესადარებელი გაჯერების მისაღწევად.
√ ტრანსკრიპტის სტრუქტურის იდენტიფიკაცია
მრავალფეროვანი სტრუქტურული ვარიანტების იდენტიფიცირება თითოეული ტრანსკრიპტის კონსენსუსის სრული სიგრძის წაკითხვით
√ ტრანსკრიპტის დონის დიფერენციალური ანალიზი - მოკლე წაკითხვით დამალული ცვლილებების გამოვლენა
მითითება
Tang AD, Soulette CM, Baren MJV და სხვ.ქრონიკული ლიმფოციტური ლეიკემიის დროს SF3B1 მუტაციის სრულმეტრაჟიანი ტრანსკრიპტის დახასიათება ავლენს შეკავებული ინტრონების დაქვეითებას [J].ბუნების კომუნიკაციები.
ტექნიკური და მაჩვენებლები მიზნად ისახავს სხვადასხვა მაღალი გამტარუნარიანობის თანმიმდევრობის ტექნოლოგიების უახლესი წარმატებული გამოყენების გაზიარებას სხვადასხვა კვლევის ასპარეზზე, ასევე ბრწყინვალე იდეების ექსპერიმენტულ დიზაინსა და მონაცემთა მოპოვებაში.
გამოქვეყნების დრო: იან-08-2022