ერთბირთვიანი რნმ-ის სეკვენირება
ტექნიკური სქემა
ბირთვების იზოლირება მიიღწევა 10× Genomics Chromium™-ის მეშვეობით, რომელიც შედგება რვაარხიანი მიკროფლუიდიკური სისტემისგან ორმაგი გადაკვეთებით. ამ სისტემაში, გელის მძივები შტრიხკოდებითა და პრაიმერით, ფერმენტებითა და ერთი ბირთვით არის კაფსულირებული ნანოლიტრის ზომის ზეთის წვეთში, რაც წარმოქმნის გელის მძივს ემულსიაში (GEM). GEM-ის წარმოქმნის შემდეგ, თითოეულ GEM-ში ხორციელდება უჯრედის ლიზისი და შტრიხკოდების გამოთავისუფლება. mRNA უკუ ტრანსკრიფცირდება cDNA მოლეკულებად 10× შტრიხკოდებითა და UMI-ით, რომლებიც შემდგომში ექვემდებარება სტანდარტული სეკვენირების ბიბლიოთეკის აგებას.
მახასიათებლები
● გაყინული ქსოვილებიდან ერთბირთვიანი სუსპენზიის მომზადება
● გელის მძივების ემულსიაში (GEM) ფორმირება, რასაც მოჰყვება cDNA სინთეზი
● GEM-ის თითოეული მძივი დატვირთულია პრაიმერებით, რომლებიც შედგება 4 სექციისგან:
პოლი(dT) კუდი mRNA პრაიმინგისა და cDNA სინთეზისთვის,
უნიკალური მოლეკულური იდენტიფიკატორი (UMI) ამპლიფიკაციის მიკერძოების გამოსასწორებლად
10x შტრიხკოდი
ნაწილობრივი წაკითხვის 1 სეკვენირების პრაიმერის შეკავშირების თანმიმდევრობა
უპირატესობები
ერთბირთვიანი რნმ-ის სეკვენირება გვერდს უვლის ერთუჯრედიანი რნმ-ის სეკვენირების შეზღუდვებს, რაც საშუალებას იძლევა:
● გაყინული ნიმუშების გამოყენება და არა მხოლოდ ახალი ნიმუშებით შემოიფარგლება
● გაყინული უჯრედების დაბალი სტრესი ახალი უჯრედების ფერმენტულ დამუშავებასთან შედარებით, რაც აისახება ტრანსკრიპტომულ მონაცემებში სტრესით გამოწვეული გენების ნაკლები რაოდენობით.
● სისხლის წითელი უჯრედების წინასწარი ამოღება საჭირო არ არის
● შეუზღუდავი უჯრედის დიამეტრი
● ანალიზისთვის შესაფერისი ნიმუშების ფართო სპექტრი, მათ შორის რთული და მყიფე ქსოვილების ტიპები, რომლებიც მიდრეკილნი არიან უჯრედების შეწებების ან განადგურებისკენ ქსოვილების დისოციაციის დროს
ნიმუშები, რომელთა ანალიზი შეუძლებელია ერთუჯრედიანი რნმ-ის სეკვენირებით და რომლებიც ვარგისია ერთბირთვიანი რნმ-ის სეკვენირებისთვის:
| უჯრედი / ქსოვილი | მიზეზი |
| ახლად გაყინული ქსოვილი | ახალი ან დიდი ხნის წინ შენახული ორგანიზაციების მიღება შეუძლებელია |
| კუნთოვანი უჯრედი, მეგაკარიოციტი, ცხიმი… | უჯრედის დიამეტრი ძალიან დიდია ინსტრუმენტში შესასვლელად |
| ღვიძლის… | ძალიან მყიფეა გასატეხად, ვერ ახერხებს ცალკეული უჯრედების გარჩევას |
| ნეირონული უჯრედი, ტვინი… | უფრო მგრძნობიარე, ადვილად დასაძაბავი, შეცვლის თანმიმდევრობის შედეგებს |
| პანკრეასი, ფარისებრი ჯირკვალი… | მდიდარია ენდოგენური ფერმენტებით, რომლებიც გავლენას ახდენენ ერთუჯრედიანი სუსპენზიის წარმოებაზე |
ერთბირთვიანი vs ერთუჯრედიანი
| ერთბირთვიანი | ერთუჯრედიანი |
| შეუზღუდავი უჯრედის დიამეტრი | უჯრედის დიამეტრი: 10-40 მკმ |
| მასალა შეიძლება იყოს გაყინული ქსოვილი | მასალა უნდა იყოს ახალი ქსოვილი |
| გაყინული უჯრედების დაბალი სტრესი | ფერმენტულმა მკურნალობამ შეიძლება გამოიწვიოს უჯრედული სტრესული რეაქცია |
| სისხლის წითელი უჯრედების ამოღება საჭირო არ არის | სისხლის წითელი უჯრედების მოცილება აუცილებელია |
| ბირთვული გამოხატავს ბიოინფორმაციას | მთელი უჯრედი გამოხატავს ბიოინფორმაციას |
სპეციფიკაციები
| ნიმუშის მოთხოვნები | ბიბლიოთეკა | სეკვენირების სტრატეგია | რეკომენდებული მონაცემები | ხარისხის კონტროლი |
| ცხოველური ქსოვილი ≥ 200 მგ მცენარეული ქსოვილი ≥ 400 მგ | 10x Genomics sn cDNA ბიბლიოთეკა | ილუმინა PE150 | 100 ათასი PE წაკითხვა თითო უჯრედზე (100-200 გბ) | 700-1200 ბირთვი/μl და ბირთვების მთლიანობა მიკროსკოპით დაფიქსირდა |
ნიმუშის მომზადების ინსტრუქციისა და მომსახურების სამუშაო პროცესის შესახებ დამატებითი ინფორმაციისთვის, გთხოვთ, თავისუფლად დაუკავშირდეთBMKGENE-ის ექსპერტი
მომსახურების სამუშაო ნაკადი
მოიცავს შემდეგ ანალიზს:
● ხარისხის კონტროლი: უჯრედების რაოდენობა, გენის აღმოჩენა, უჯრედების ზუსტი იდენტიფიკაცია, რნმ-ის მოლეკულები და ექსპრესიის რაოდენობრივი განსაზღვრა
● შინაგანი ნიმუშის ანალიზი:
უჯრედების კლასტერიზაცია და კლასტერული ანოტაცია
დიფერენციალური ექსპრესიის ანალიზი: DEG-ების იდენტიფიცირება კლასტერებში
კლასტერული DEG-ების ფუნქციური ანოტაცია და გამდიდრება
● ჯგუფთაშორისი ანალიზი:
მონაცემთა კომბინაცია
დიფერენციალური გამოხატვის ანალიზი: DEG-ების იდენტიფიცირება ჯგუფებში
ჯგუფური DEG-ების ფუნქციური ანოტაცია და გამდიდრება
● გაფართოებული ანალიზი:
უჯრედული ციკლის ანალიზი
ფსევდოდროის ანალიზი
ფიჭური კომუნიკაციის ანალიზი (CellPhoneDB)
გენების ნაკრების გამდიდრების ანალიზი (GSEA)
შიდა ნიმუშის ანალიზი
უჯრედების კლასტერიზაცია:
დიფერენციალური გამოხატვის ანალიზი: კლასტერული DEG-ები
ჯგუფთაშორისი ანალიზი
დიფერენციალური გამოხატვის ანალიზი: ჯგუფური DEG-ები
გაფართოებული ანალიზი:
ფსევდოდროის ანალიზი:
უჯრედული ციკლის ანალიზი:
გაეცანით BMKGene-ის ერთბირთვიანი რნმ-ის სეკვენირების სერვისების მიერ 10X Chromium-ის მიერ ხელშეწყობულ მიღწევებს ამ რჩეულ პუბლიკაციებში:
ვანგი, ლ. და სხვ. (2021) „ერთუჯრედიანი ტრანსკრიპტომიური ანალიზი ავლენს ფილტვების იმუნურ ლანდშაფტს სტეროიდ-რეზისტენტული ასთმის გამწვავების დროს“,ამერიკის შეერთებული შტატების მეცნიერებათა ეროვნული აკადემიის შრომები, 118(2), გვ. e2005590118. doi: 10.1073/pnas.2005590118
ჟენგი, ჰ. და სხვ. (2022) „გრეივსის დაავადებისა და ჰაშიმოტოს თირეოიდიტის მიკროგარემოში იმუნურ უჯრედებში დისრეგულირებული გენის ექსპრესიისა და პათოლოგიური მეტაბოლური სიგნალიზაციის გლობალური მარეგულირებელი ქსელი“.იმუნოლოგიის საზღვრები, 13, გვ. 879824. doi: 10.3389/FIMMU.2022.879824/BIBTEX.
ტიანი, ჰ. და სხვ. (2023) „ერთუჯრედიანი ტრანსკრიპტომი ავლენს ლეიკოციტების ჰეტეროგენულობას და იმუნურ რეაქციებს კალმახის (Paralichthys olivaceus) ინაქტივირებული Edwardsiella tarda-თი ვაქცინაციის შემდეგ“.აკვაკულტურა, 566, გვ. 739238. doi: 10.1016/J.AQUACULTURE.2023.739238.
იუ, ი. და სხვ. (2023) „ფოტოდინამიკური თერაპია აუმჯობესებს იმუნური ჩეკპოინტის ინჰიბიტორების შედეგს სიმსივნის საწინააღმდეგო იმუნიტეტის რემოდელირების გზით კუჭის კიბოს მქონე პაციენტებში“.კუჭის კიბო, 26(5), გვ. 798–813. doi: 10.1007/S10120-023-01409-X/METRICS.
