Толук узундуктагы мРНК секвенирлөө -PacBio
Кызматтын артыкчылыктары
● Толук узундуктагы кДНК молекуласын 3'- учунан 5'- аягына чейин түз окуу
● Изо-форма деңгээлиндеги резолюция ырааттуулук структурасында
● Жогорку тактык жана бүтүндүктөгү стенограммалар
● Vaiours түрлөрүнө абдан шайкеш келет
● 4 PacBio Sequel II секвенирлөө платформалары менен жабдылган чоң секвенирлөө жөндөмдүүлүгү
● 700дөн ашык Pacbio негизиндеги РНК секвенирлөө долбоорлору боюнча тажрыйбалуу
● BMKCloud негизинде жыйынтык жеткирүү: платформада жеткиликтүү жекелештирилген маалыматтарды казып алуу.
● Долбоор аяктагандан кийин 3 айга жарактуу сатуудан кийинки кызматтар
Кызмат спецификациялары
Платформа: PacBio Sequel II
Секвенция китепканасы: Poly A- байытылган мРНК китепканасы
Сунушталган маалымат кирешеси: 20 Гб/үлгү (түргө жараша)
FLNC（%）: ≥75%
*FLNC: Толук узундуктагы химерикалык эмес транскрипттер
Биоинформатика анализи
● чийки маалыматтарды иштетүү
● Транскрипттин идентификациясы
● Ырааттуулук структурасы
● Экспресстин санын аныктоо
● Функциянын аннотациясы
Үлгү талаптары жана жеткирүү
Үлгү талаптары:
Нуклеотиддер:
| Конц.(нг/мкл) | Суммасы (мкг) | Тазалык | актык |
| ≥ 120 | ≥ 0,6 | OD260/280=1,7-2,5 OD260/230=0,5-2,5 Чектелген же жок белок же ДНК булганышы гелде көрсөтүлгөн. | Өсүмдүктөр үчүн: RIN≥7,5; Жаныбарлар үчүн: RIN≥8,0; 5.0≥ 28S/18S≥1.0; чектелген же негизги бийиктиги жок |
Кыртыш: Салмагы (кургак):≥1 г
*5 мг аз кыртыш үчүн, биз жарк-тоңдурулган (суюк азотто) кыртыш үлгүсүн жөнөтүүнү сунуштайбыз.
Клетка суспензиясы:Клеткалардын саны = 3×106- 1×107
*Биз тоңдурулган клетка лизатын жөнөтүүнү сунуштайбыз.Бул клетка 5×10дон азыраак эсептелген учурда5, суюк азотто тоңдурулган флеш сунушталат, ал микро экстракция үчүн артыкчылыктуу.
Кан үлгүлөрү:Көлөмү≥1 мл
Микроорганизм:Массасы ≥ 1 г
Сунушталган үлгү жеткирүү
Контейнер:
2 мл центрифуга түтүгү (калай фольга сунушталбайт)
Үлгү этикеткалоо: Топ+репликация, мисалы, A1, A2, A3;B1, B2, B3... ...
Жөнөтүү:
1. Кургак муз: Үлгүлөрдү баштыктарга салып, кургак музга көмүү керек.
2. RNAstable түтүктөр: РНК үлгүлөрүн РНКны турукташтыруучу түтүктө (мисалы, RNAstable®) кургатып, бөлмө температурасында жөнөтүүгө болот.
Кызматтын иш агымы
Эксперимент дизайны
Үлгү жеткирүү
РНК экстракциясы
Китепкананын курулушу
Секвенциялоо
Маалыматтарды талдоо
Сатуудан кийинки кызматтар
1.FLNC узундугун бөлүштүрүү
Толук узундуктагы химерикалык эмес окуунун узундугу (FLNC) китепкана куруудагы cDNAнын узундугун көрсөтөт.FLNC узундугун бөлүштүрүү китепкананын курулушунун сапатын баалоодо маанилүү көрсөткүч болуп саналат.
FLNC окуу узундугун бөлүштүрүү
2.Complete ORF аймак узундугу бөлүштүрүү
Биз TransDecoderди протеинди коддоочу аймактарды жана бардык үлгүлөрдөгү толук ашыкча эмес транскрипт маалыматты камтыган униген топтомдорун түзүү үчүн тиешелүү аминокислота ырааттуулугун болжолдоо үчүн колдонобуз.
ORF аймагынын узундугун толук бөлүштүрүү
3.KEGG жолду байытуу анализи
Дифференциалдык экспрессияланган транскрипттерди (DETs) PacBio секвенирлөө маалыматтары тарабынан түзүлгөн толук узундуктагы транскрипт топтомдорундагы NGS негизиндеги РНК секвенирлөө маалыматтарын тегиздөө аркылуу аныктоого болот.Бул DETs ар кандай функционалдык талдоо үчүн, мисалы, KEGG жолун байытуу анализи үчүн дагы иштетилет.
DET KEGG жолду байытуу -Чекит сюжети
BMK Case
Populus сабагынын транскриптомунун өнүгүү динамикасы
Жарыяланган: Өсүмдүк биотехнологиясы журналы, 2019
Тартиптештирүү стратегиясы:
Үлгү чогултуу:өзөк аймактары: чокусу, биринчи internode(IN1), экинчи internode(IN2), үчүнчү internode(IN3), internode(IN4) жана internode(IN5) Nanlin895
NGS ырааттуулугу:15 адамдын РНКсы бир биологиялык үлгү катары бириктирилген.Ар бир пункттун үч биологиялык репликасы NGS ырааттуулугу үчүн иштетилди
TGS ырааттуулугу:Сабактын аймактары үч аймакка бөлүнгөн, башкача айтканда, апекс, IN1-IN3 жана IN4-IN5.Ар бир аймак төрт типтеги китепканалар менен PacBio секвенциясы үчүн иштетилген: 0-1 кб, 1-2 кб, 2-3 кб жана 3-10 кб.
Негизги жыйынтыктар
1. Бардыгы болуп 87150 толук метраждуу транскрипт аныкталган, аларда 2081 жаңы изоформа жана 62058 жаңы альтернативалуу изоформалар аныкталган.
2.1187 lncRNA жана 356 синтез гени аныкталган.
3.Биринчи өсүштөн экинчилик өсүшкө чейин 995 дифференциалдуу экспрессияланган гендердин 15838 дифференциалдуу транскрипциясы аныкталган.Бардык DEGде 1216 транскрипция факторлору болгон, алардын көбү азырынча билдириле элек.
4.GO байытуу анализи биринчилик жана экинчилик өсүүдө клетканын бөлүнүшүнүн жана кычкылдануу-калыбына келтирүү процессинин маанилүүлүгүн аныктады.
Альтернативдик бириктирүү окуялары жана ар кандай изоформалар
Транскрипция факторлору боюнча WGCNA талдоо
Шилтеме
Чао К, Гао ЗФ, Чжан Д, ж.б.Populus сабагынын транскриптомунун өнүгүү динамикасы.Plant Biotechnol J. 2019;17(1):206-219.doi:10.1111/pbi.12958
