Толук узундуктагы мРНК ырааттуулугу-нанопур
Кызматтын артыкчылыктары
● Төмөн ырааттуулук
● Толук узундуктагы cDNA молекулаларын ачуу
● Бир эле сандагы стенограммаларды жабуу үчүн азыраак маалымат талап кылынат
● Бир генге бир нече изоформаларды аныктоо
● Изоформа деңгээлинде туюнтмалардын квантификациясы
Кызмат спецификациялары
| Китепкана | Платформа | Сунушталган маалымат кирешелүүлүгү (Гб) | Сапатты көзөмөлдөө |
| cDNA-PCR(Poly-A байытылган) | Nanopore PromethION P48 | 6 Гб/үлгү (түргө жараша) | Толук узундуктун катышы＞70% Орточо сапат баллы: Q10
|
Биоинформатика анализи
●Чийки маалыматтарды иштетүү
● Транскрипттин идентификациясы
● Альтернативалык бириктирүү
● Ген деңгээлинде жана изоформа деңгээлинде экспрессиянын сандык көрсөткүчтөрү
● Дифференциалдык туюнтма анализи
● Функцияга аннотация жана байытуу (DEGs жана DETs)
Үлгү талаптары жана жеткирүү
Үлгү талаптары:
Нуклеотиддер:
| Конц.(нг/мкл) | Суммасы (мкг) | Тазалык | актык |
| ≥ 100 | ≥ 0,6 | OD260/280=1,7-2,5 OD260/230=0,5-2,5 Чектелген же жок белок же ДНК булганышы гелде көрсөтүлгөн. | Өсүмдүктөр үчүн: RIN≥7,0; Жаныбарлар үчүн: RIN≥7,5; 5.0≥28S/18S≥1.0; чектелген же негизги бийиктиги жок |
Кыртыш: Салмагы (кургак): ≥1 г
*5 мг аз кыртыш үчүн, биз жарк-тоңдурулган (суюк азотто) кыртыш үлгүсүн жөнөтүүнү сунуштайбыз.
Клетка суспензиясы: Клеткалардын саны = 3×106- 1×107
*Биз тоңдурулган клетка лизатын жөнөтүүнү сунуштайбыз.Бул клетка 5×10дон азыраак эсептелген учурда5, суюк азотто тоңдурулган флеш сунушталат, ал микро экстракция үчүн артыкчылыктуу.
Кан үлгүлөрү: Volume≥1 мл
Сунушталган үлгү жеткирүү
Контейнер: 2 мл центрифуга түтүгү (калай фольга сунушталбайт)
Үлгү этикеткалоо: Топ+репликация, мисалы, A1, A2, A3;B1, B2, B3... ...
Жеткирүү: 2, Кургак муз: Үлгүлөрдү баштыктарга салып, кургак музга көмүү керек.
- RNAstable түтүктөр: РНК үлгүлөрүн РНК стабилдештирүү түтүкчөсүндө (мисалы, RNAstable®) кургатып, бөлмө температурасында жөнөтүүгө болот.
Кызматтын иш агымы
Нуклеотиддер:
Үлгү жеткирүү
Китепкананын курулушу
Секвенциялоо
Маалыматтарды талдоо
Сатуудан кийинки кызматтар
Кызматтын иш агымы
кыртыш:
Эксперимент дизайны
Үлгү жеткирүү
РНК экстракциясы
Китепкананын курулушу
Секвенциялоо
Маалыматтарды талдоо
Сатуудан кийинки кызматтар
1.Дифференциалдык экспрессиялык анализ -Вулкан сюжети
Дифференциалдык экспрессия анализи дифференциалдык экспрессияланган гендерди (DEGs) аныктоо үчүн ген деңгээлинде да, дифференциалдык түрдө аныктоо үчүн изоформа деңгээлинде да иштетилиши мүмкүн.
билдирилген транскрипттер (DETs)
2.Иерархиялык кластердик жылуулук картасы
3.Alternative splicing идентификация жана классификация
Альтернативдик сплайсинг окуяларынын беш түрүн Astalavista тарабынан алдын ала айтууга болот.
4.Альтернативалык поли-аденилдөө (APA) окуяларын аныктоо жана мотив поли-Адан 50 бит жогору
BMK Case
Альтернативалык сплайсинг идентификациясы жана изоформа деңгээлиндеги сандык нанопуралык толук узундуктагы транскриптомдук секвенирлөө аркылуу
Жарыяланган:Nature Communications, 2020
Тартиптештирүү стратегиясы:
Топтоо: 1. CLL-SF3B1(WT);2. CLL-SF3B1(K700E мутация);3. Кадимки В-клеткалар
Ырааттуулук стратегиясы: MinION 2D китепкана секвенирлөө, PromethION 1D китепкана секвенирлөө;ошол эле үлгүлөрдөн кыска окуу маалыматтар
Sequencing платформасы: Nanopore MinION;Nanopore PromethION;
Негизги жыйынтыктар
1.Изоформ-деңгээлдеги Альтернативдик Splicing идентификациясы
Узак окулган тизмектер мутант SF3B1ди идентификациялоого мүмкүнчүлүк беретK700E- изоформа деңгээлинде өзгөртүлгөн бириктирүү жерлери.35 альтернативалуу 3′SS жана 10 альтернативдик 5′SS SF3B1 ортосунда олуттуу айырмаланганы аныкталды.K700Eжана SF3B1WT.35 өзгөртүүнүн 33ү көптөн бери окуган тизмектер аркылуу жаңыдан ачылган.
2.Изоформа-деңгээлдеги Альтернативдик Splicing сандык аныктоо
SF3B1де интрон кармап калуу (IR) изоформаларынын экспрессиясыK700Eжана SF3B1WTSF3B1деги IR изоформаларынын глобалдык төмөндөөсүн ачып, нанотерек ырааттуулугунун негизинде сандык аныкталды.K700E.
Шилтеме
Танг AD, Soulette CM, Baren MJV, ж.б.Өнөкөт лимфоцитардык лейкоздо SF3B1 мутациясынын толук узундуктагы транскрипт мүнөздөмөсү сакталып калган интрондордун [J] төмөндөшүн көрсөтөт.Nature Communications.
