PacBio 2+3 ການແກ້ໄຂບັນຫາ mRNA ເຕັມຄວາມຍາວ
ຄຸນສົມບັດ
● ການອອກແບບການສຶກສາ:
ຕົວຢ່າງທີ່ລວມກັນຕາມລໍາດັບດ້ວຍ PacBio ເພື່ອກໍານົດ isoforms ການຖອດຂໍ້ຄວາມ
ຕົວຢ່າງແຍກຕ່າງຫາກ (replicates ແລະເງື່ອນໄຂທີ່ຈະທົດສອບ) sequenced ກັບNGS ເພື່ອປະເມີນການສະແດງອອກຂອງການຖອດຂໍ້ຄວາມ
● ການຈັດລໍາດັບ PacBio ໃນໂໝດ CCS, ສ້າງການອ່ານ HiFi
● ການຈັດລໍາດັບຂອງຂໍ້ຄວາມຖອດຈາກສຽງສະບັບເຕັມ
● ການວິເຄາະບໍ່ຈໍາເປັນຕ້ອງມີ genome ອ້າງອີງ; ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ມັນອາດຈະໄດ້ຮັບການຈ້າງງານ
● ການວິເຄາະທາງຊີວະພາບບໍ່ພຽງແຕ່ປະກອບມີການສະແດງອອກໃນລະດັບ gene ແລະ isoform, ແຕ່ຍັງການວິເຄາະຂອງ lncRNA, gene fusions, poly-adenylation, ແລະໂຄງສ້າງຂອງ gene
ຂໍ້ດີ
● ຄວາມຖືກຕ້ອງສູງ: HiFi ອ່ານດ້ວຍຄວາມຖືກຕ້ອງ > 99.9% (Q30), ທຽບກັບ NGS
● ການວິເຄາະ Splicing ທາງເລືອກ: ການຈັດລໍາດັບການຖອດຂໍ້ຄວາມທັງໝົດເຮັດໃຫ້ການກໍານົດ ແລະລັກສະນະ isoform.
● ການປະສົມຂອງ PacBio ແລະ NGS Strengths: ເຮັດໃຫ້ປະລິມານການສະແດງອອກໃນລະດັບ isoform, ເປີດເຜີຍການປ່ຽນແປງທີ່ອາດຈະຖືກປິດບັງໃນເວລາທີ່ການວິເຄາະການສະແດງອອກຂອງ gene ທັງຫມົດ
● ຊ່ຽວຊານຢ່າງກວ້າງຂວາງ: ດ້ວຍບັນທຶກການຕິດຕາມຂອງການເຮັດສໍາເລັດຫຼາຍກວ່າ 1100 PacBio ໂຄງການ transcriptome ທີ່ມີຄວາມຍາວເຕັມແລະການປຸງແຕ່ງຫຼາຍກວ່າ 2300 ຕົວຢ່າງ, ທີມງານຂອງພວກເຮົານໍາເອົາປະສົບການທີ່ອຸດົມສົມບູນໃຫ້ກັບທຸກໆໂຄງການ.
● ສະຫນັບສະຫນູນການຂາຍຫຼັງການຂາຍ: ຄໍາຫມັ້ນສັນຍາຂອງພວກເຮົາຂະຫຍາຍອອກໄປນອກເຫນືອຈາກການສໍາເລັດໂຄງການທີ່ມີໄລຍະເວລາການບໍລິການຫລັງການຂາຍ 3 ເດືອນ. ໃນລະຫວ່າງເວລານີ້, ພວກເຮົາສະເຫນີການຕິດຕາມໂຄງການ, ການຊ່ວຍເຫຼືອການແກ້ໄຂບັນຫາ, ແລະກອງປະຊຸມ Q&A ເພື່ອແກ້ໄຂຄໍາຖາມໃດໆທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບຜົນໄດ້ຮັບ.
ຄວາມຕ້ອງການຕົວຢ່າງແລະການຈັດສົ່ງ
| ຫໍສະໝຸດ | ຍຸດທະສາດການຈັດລໍາດັບ | ຂໍ້ມູນແນະນໍາ | ການຄວບຄຸມຄຸນນະພາບ |
| ຫ້ອງສະໝຸດ mRNA CCS ທີ່ອຸດົມໄປດ້ວຍ PolyA | PacBio Sequel II PacBio Revio | 20/40 Gb 5/10 M CCS | Q30≥85% |
| ອຸດົມດ້ວຍໂພລີ A | Illumina PE150 | 6-10 Gb | Q30≥85% |
ນິວຄລີໂອທີນ
|
| Conc.(ng/μl) | ປະລິມານ (μg) | ຄວາມບໍລິສຸດ | ຄວາມຊື່ສັດ |
| ຫໍສະໝຸດ Illumina | ≥ 10 | ≥ 0.2 | OD260/280=1.7-2.5 OD260/230=0.5-2.5 ຈໍາກັດຫຼືບໍ່ມີການປົນເປື້ອນທາດໂປຼຕີນຫຼື DNA ທີ່ສະແດງຢູ່ໃນເຈນ. | ສໍາລັບພືດ: RIN≥4.0; ສໍາລັບສັດ: RIN≥4.5; 5.0≥28S/18S≥1.0; ຂອບເຂດຈໍາກັດ ຫຼືບໍ່ມີລະດັບຄວາມສູງ |
| ຫໍສະໝຸດ PacBio | ≥ 100 | ≥ 1.0 | OD260/280=1.7-2.5 OD260/230=0.5-2.5 ຈໍາກັດຫຼືບໍ່ມີການປົນເປື້ອນທາດໂປຼຕີນຫຼື DNA ທີ່ສະແດງຢູ່ໃນເຈນ. | ພືດ: RIN≥7.5 ສັດ: RIN≥8.0 5.0≥28S/18S≥1.0; ຂອບເຂດຈໍາກັດ ຫຼືບໍ່ມີລະດັບຄວາມສູງ |
ການຈັດສົ່ງຕົວຢ່າງທີ່ແນະນໍາ
ບັນຈຸ: ທໍ່ centrifuge 2 ມລ (ບໍ່ແນະນໍາໃຫ້ໃຊ້ຟອຍກົ່ວ)
ການຕິດສະຫຼາກຕົວຢ່າງ: Group+replicate ເຊັ່ນ: A1, A2, A3; B1, B2, B3.
ການຂົນສົ່ງ:
1. ນ້ຳກ້ອນແຫ້ງ:ຕົວຢ່າງຕ້ອງຖືກບັນຈຸໃນຖົງແລະຝັງຢູ່ໃນກ້ອນແຫ້ງ.
2. ທໍ່ RNAstable: ຕົວຢ່າງ RNA ສາມາດຕາກແຫ້ງໃນທໍ່ສະຖຽນລະພາບ RNA (ເຊັ່ນ: RNAstable®) ແລະສົ່ງໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງ.
ລວມມີການວິເຄາະຕໍ່ໄປນີ້:
ການຄວບຄຸມຄຸນນະພາບຂໍ້ມູນດິບ
ການວິເຄາະ Polyadenylation ທາງເລືອກ (APA)
ການວິເຄາະການຖອດຖອນບົດຄວາມ Fusion
ການວິເຄາະ Splicing ທາງເລືອກ
Benchmarking Universal Single-Copy Orthlogs (BUSCO) ການວິເຄາະ
ການວິເຄາະການຖອດຖອນບົດເລື່ອງໃໝ່: ການຄາດຄະເນຂອງລຳດັບການເຂົ້າລະຫັດ (CDS) ແລະຄຳບັນຍາຍທີ່ເປັນປະໂຫຍດ
ການວິເຄາະ lncRNA: ການຄາດຄະເນຂອງ lncRNA ແລະເປົ້າຫມາຍ
ການລະບຸ MicroSatelite (SSR)
ການວິເຄາະການຖອດຂໍ້ຄວາມທີ່ສະແດງອອກທີ່ແຕກຕ່າງກັນ (DETs).
ການວິເຄາະ Genes ສະແດງອອກທີ່ແຕກຕ່າງກັນ (DEGs).
ຄໍາບັນຍາຍທີ່ມີປະໂຫຍດຂອງ DEGs ແລະ DETs
ການວິເຄາະ BUSCO
ການວິເຄາະ Splicing ທາງເລືອກ
ການວິເຄາະ Polyadenylation ທາງເລືອກ (APA)
ພັນທຸ ກຳ ທີ່ສະແດງອອກທີ່ແຕກຕ່າງກັນ (DEGs) ແລະຂໍ້ຄວາມຖອດຈາກສຽງ (ການວິເຄາະ DETs9
ເຄືອຂ່າຍປະຕິສໍາພັນຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກທາດໂປຼຕີນຈາກ DETs ແລະ DEGs
ສຳຫຼວດຄວາມກ້າວໜ້າທີ່ອຳນວຍຄວາມສະດວກໂດຍການຈັດຮຽງລຳດັບ mRNA ຄວາມຍາວເຕັມຂອງ BMKGene ຜ່ານການເກັບກໍາສິ່ງພິມທີ່ຄັດສັນມາ.
Chao, Q. et al. (2019) 'ນະໂຍບາຍດ້ານການພັດທະນາຂອງ stem transcriptome', Plant Biotechnology Journal, 17(1), ໜ້າ 206–219. doi: 10.1111/PBI.12958.
Deng, H. et al. (2022) 'ການປ່ຽນແປງແບບເຄື່ອນໄຫວຂອງເນື້ອໃນອາຊິດ Ascorbic ໃນລະຫວ່າງການພັດທະນາໝາກ ແລະ ການສຸກຂອງໝາກ Actinidia latifolia (ການປູກພືດໝາກໄມ້ທີ່ອຸດົມສົມບູນ Ascorbate) ແລະ ກົນໄກໂມເລກຸນທີ່ກ່ຽວຂ້ອງ', International Journal of Molecular Sciences, 23(10), ໜ້າ. 5808. doi: 10.3390/IJMS23105808/S1.
Hua, X. et al. (2022) 'ການຄາດເດົາປະສິດທິພາບຂອງເຊື້ອສາຍທາງຊີວະສັງເຄາະທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບໂພລີຟີລິນທາງຊີວະພາບໃນປາຣີໂພລີຟີລາ', ຊີວະວິທະຍາການສື່ສານ 2022 5:1, 5(1), ໜ້າ 1–10. doi: 10.1038/s42003-022-03000-z.
Liu, M. et al. (2023) 'ການປະສົມ PacBio Iso-Seq ແລະ Illumina RNA-Seq ການວິເຄາະຂອງ Tuta absoluta (Meyrick) Transcriptome ແລະ Cytochrome P450 Genes', ແມງໄມ້, 14(4), p. 363. doi: 10.3390/INSECTS14040363/S1.
Wang, Lijun et al. (2019) 'ການສຳຫຼວດຄວາມຊັບຊ້ອນການຖອດຂໍ້ຄວາມໂດຍໃຊ້ PacBio ການວິເຄາະແບບສົດໆໂມເລກຸນດຽວກັບການຈັດລຳດັບ Illumina RNA ເພື່ອຄວາມເຂົ້າໃຈທີ່ດີຂຶ້ນຂອງຊີວະສັງເຄາະອາຊິດ ricinoleic ໃນ Ricinus communis', BMC Genomics, 20(1), ໜ້າ 1-17. doi: 10.1186/S12864-019-5832-9/ FIGURES/7.
