page_head_bg

Jaunumi

TRANSKRIPTOMIKA

dabu
KOMUNIKĀCIJAS

SF3B1 mutācijas pilna garuma transkripta raksturojums hroniskas limfoleikozes gadījumā atklāj saglabāto intronu pazemināšanos

Pilna garuma atšifrējumi|Nanoporu sekvencēšana|Alternatīvā izoformu analīze

Fons

SPlaši ziņots, ka splicēšanas faktora SF3B1 omatiskās mutācijas ir saistītas ar dažādiem vēža veidiem, tostarp hronisku limfoleikozi (CLL), uveal melanomu, krūts vēzi utt. Turklāt īsi nolasīti transkriptomiskie pētījumi ir atklājuši novirzes, ko izraisa SF3B1 mutācijas.Tomēr pētījumi par šiem alternatīvajiem savienošanas modeļiem jau sen ir aprobežoti ar notikumu līmeni un zināšanu trūkumu par izoformu līmeni, jo ir ierobežoti īsi nolasāmi saliktie transkripti.Šeit tika ieviesta nanoporu sekvencēšanas platforma, lai ģenerētu pilna garuma transkriptus, kas deva iespēju pārbaudīt AS izoformas.

Eksperimentālais dizains

Eksperimenti

Grupēšana:1. CLL-SF3B1(WT) 2. CLL-SF3B1 (K700E mutācija);3. Normālas B-šūnas
Secības noteikšanas stratēģija:MinION 2D bibliotēkas sekvencēšana, PromethION 1D bibliotēkas sekvencēšana;īsi nolasīti dati no tiem pašiem paraugiem
Sekvences platforma:ONT MinION;ONT PromethION;

Bioinformātiskā analīze

FIG1

Rezultāti

Akopā tika ģenerēti 257 miljoni nolasījumu no 6 CLL paraugiem un 3 B šūnām.Vidēji 30,5% no šiem lasījumiem tika identificēti kā pilna garuma transkripti.

FRNS (FLAIR) pilna garuma alternatīvo izoformu analīze tika izstrādāta, lai radītu augstas ticamības izoformu kopu.FLAIR var apkopot šādi:

Nanopore nolasa izlīdzināšanu: identificē vispārējo transkripta struktūru, pamatojoties uz atsauces genomu;

Splice savienojuma korekcija: labojiet secības kļūdas (sarkanā krāsā) ar savienojuma vietu no anotētiem introniem, introniem no īsi nolasītiem datiem vai abiem;

Collapse: apkopo reprezentatīvās izoformas, pamatojoties uz savienojuma savienojuma ķēdēm (pirmās plūsmas komplekts).Atlasiet augstas ticamības izofrom, pamatojoties uz atbalsta nolasījumu skaitu (slieksnis: 3).

FIG2

1. attēls. FLAIR analīze, lai identificētu pilna garuma izoformas, kas saistītas ar SF3B1 mutāciju HLL

FLAIR identificēja 326 699 augstas ticamības savienotās izoformas, no kurām 90% ir jaunas izoformas.Tika konstatēts, ka lielākā daļa no šīm neanotētajām izoformām ir jaunas zināmu savienojuma savienojumu kombinācijas (142 971), savukārt pārējās jaunās izoformas saturēja vai nu saglabātu intronu (21 700), vai jaunu eksonu (3594).

Lnepārtrauktas nolasīšanas sekvences ļauj identificēt mutantu SF3B1-K700E izmainītas salaiduma vietas izoformas līmenī.Tika konstatēts, ka 35 alternatīvas 3'SS un 10 alternatīvas 5'SS ir ievērojami atšķirīgi savienotas starp SF3B1-K700E un SF3B1-WT.33 no 35 izmaiņām tika jaunatklātas ar ilgi lasītām sekvencēm.Nanopore datos attāluma sadalījums starp SF3B1-K700E izmainītajiem 3'SS līdz kanonisko vietu maksimumiem ir aptuveni -20 bp, kas būtiski atšķiras no kontroles sadalījuma, līdzīgi tam, kas ziņots CLL īsas nolasīšanas sekvencēs.Tika analizētas ERGIC3 gēna izoformas, kur SF3B1-K700E tika konstatēta lielāka jauna izoforma, kas satur proksimālo savienojuma vietu.Gan proksimālais, gan distālais 3'SS bija saistīts ar atšķirīgiem AS modeļiem, kas ģenerēja vairākas izoformas.

FIG3
FIG4

2. attēls. Alternatīvie 3′ savienojuma modeļi, kas identificēti ar nanoporu sekvencēšanas datiem

IR notikumu izmantošanas analīze jau sen ir ierobežota ar īsu nolasīšanu balstītā analīzē, jo ir pārliecība par IR identifikāciju un kvantitatīvo noteikšanu.IR izoformu ekspresija SF3B1-K700E un SF3B1-WT tika kvantitatīvi noteikta, pamatojoties uz nanoporu sekvencēm, atklājot globālu IR izoformu pazemināšanos SF3B1-K700E .

4. attēls. Lauksaimniecības intensitāte un tīkla savienojamība trīs lauksaimniecības sistēmās (A un B);Meža izlases analīze (C) un saistība starp lauksaimniecības intensitāti un AMF kolonizāciju (D)

FIG5

3. attēls. Intronu nomas notikumi CLL SF3B1-K700E ir vairāk regulēti.

Tehnoloģija

Nanopore Ilgi lasīta secība

Nanoporu sekvencēšana ir vienas molekulas reāllaika elektrisko signālu sekvencēšanas tehnoloģija.
Ddivpavedienu DNS vai RNS saistās ar nanoporainu proteīnu, kas iestrādāts bioplēvē un atritinās motora proteīna vadībā.
DNA/RNS virknes sprieguma starpības ietekmē šķērso nanoporu kanāla proteīnu noteiktā ātrumā.
Molekulas ģenerē dažādus elektriskos signālus atbilstoši ķīmiskajai struktūrai.
Rsekvenču e-time noteikšana tiek panākta ar bāzes izsaukšanu.

fig6

Pilna garuma transkripta sekvencēšanas veikšana

√ Datu piesātinājums

fig7

Lai sasniegtu salīdzināmu datu piesātinājumu, nepieciešams 7 reizes mazāk nolasījumu.

√ Atšifrējuma struktūras identifikācija

fig8

Dažādu strukturālo variantu identificēšana ar vienprātīgu katra stenogrammas pilna garuma nolasījumu

√ Transkripcijas līmeņa diferenciālā analīze - Atklājiet izmaiņas, kas paslēptas īsos nolasījumos

fig9

Atsauce

Tang AD, Soulette CM, Baren MJV u.c.SF3B1 mutācijas pilna garuma transkripta raksturojums hroniskas limfoleikozes gadījumā atklāj saglabāto intronu [J] pazemināšanos.Dabas sakari.

Tehnika un svarīgākie Mērķis ir dalīties ar jaunākajiem veiksmīgākajiem dažādu augstas caurlaidības sekvencēšanas tehnoloģiju pielietojumiem dažādās pētniecības jomās, kā arī ar izcilām idejām eksperimentālajā projektēšanā un datu ieguvē.


Izlikšanas laiks: 08.01.2022

Nosūtiet mums savu ziņu: