Vienkodolu RNS sekvencēšana
Tehniskā shēma
Kodolu izolēšana tiek panākta ar 10× Genomics Chromium™, kas sastāv no astoņu kanālu mikrofluidikas sistēmas ar dubultu krustošanu. Šajā sistēmā gēla lodītes ar svītrkodiem un praimeri, enzīmi un viens kodols tiek iekapsulēti nanolitra lieluma eļļas pilienā, ģenerējot gēla lodītes emulsijā (GEM). Kad GEM ir izveidojušies, katrā GEM tiek veikta šūnu līze un svītrkodu atbrīvošana. mRNS tiek reversā transkripcijā pārvērstas kDNS molekulās ar 10× svītrkodiem un UMI, kuras tālāk tiek pakļautas standarta sekvencēšanas bibliotēkas konstrukcijai.
Funkcijas
● Vienkodolu suspensijas sagatavošana no sasaldētiem audiem
● Gela lodīšu emulsijas (GEM) veidošanās, kam seko kDNS sintēze
● Katra GEM lodīte ir piepildīta ar primeriem, kas sastāv no 4 sekcijām:
poli(dT) aste mRNS primingam un cDNS sintēzei,
Unikāls molekulārais identifikators (UMI), lai koriģētu amplifikācijas neobjektivitāti
10x svītrkods
Daļēji nolasītā 1 sekvencēšanas praimera saistīšanās secība
Priekšrocības
Vienkodola RNS sekvencēšana apiet vienšūnas RNS sekvencēšanas ierobežojumus, ļaujot:
● Saldētu paraugu izmantošana, ne tikai svaigu paraugu izmantošana
● Zemāks sasaldētu šūnu stress, salīdzinot ar svaigu šūnu fermentatīvu apstrādi, kas atspoguļojas transkriptomas datos mazāk stresa izraisītu gēnu veidā
● Nav nepieciešams iepriekš izņemt sarkanos asinsķermenīšus
● Neierobežots šūnu diametrs
● Plašs analīzei piemērotu paraugu klāsts, tostarp sarežģīti un trausli audu veidi, kuriem audu disociācijas laikā ir tendence uz šūnu salipšanu vai bojāeju
Paraugi, kurus nevar analizēt ar atsevišķu šūnu RNS sekvencēšanu un kuri ir piemēroti atsevišķu kodolu RNS sekvencēšanai:
| Šūna/audi | Iemesls |
| Nesvaigi sasaldēti audi | Nevar iegūt jaunas vai sen saglabātas organizācijas |
| Muskuļu šūna, megakariocīts, taukauda… | Šūnas diametrs ir pārāk liels, lai iekļūtu instrumentā |
| Aknas… | Pārāk trausls, lai saplīstu, nespēj atšķirt atsevišķas šūnas |
| Neironu šūna, smadzenes… | Jutīgāks, vieglāk pakļaujams stresam, mainīs sekvencēšanas rezultātus |
| Aizkuņģa dziedzeris, vairogdziedzeris… | Bagāts ar endogēniem enzīmiem, kas ietekmē atsevišķu šūnu suspensijas veidošanos |
Vienkodolu pret vienšūnu
| Vienkodolu | Vienšūnas |
| Neierobežots šūnu diametrs | Šūnas diametrs: 10–40 μm |
| Materiāls var būt sasaldēti audi | Materiālam jābūt svaigam audumam |
| Zems sasaldētu šūnu stress | Enzīmu terapija var izraisīt šūnu stresa reakciju |
| Nav nepieciešams noņemt sarkanās asins šūnas | Ir nepieciešams noņemt sarkanās asins šūnas |
| Kodols izsaka bioinformāciju | Visa šūna pauž bioinformāciju |
Specifikācijas
| Parauga prasības | Bibliotēka | Sekvencēšanas stratēģija | Ieteicamie dati | Kvalitātes kontrole |
| Dzīvnieku audi ≥ 200 mg Augu audi ≥ 400 mg | 10x Genomics sn cDNA bibliotēka | Illumina PE150 | 100 000 PE nolasījumu katrā šūnā (100–200 Gb) | 700–1200 kodoli/μl un kodolu integritāte novērota mikroskopā |
Lai iegūtu sīkāku informāciju par paraugu sagatavošanas vadlīnijām un pakalpojuma darbplūsmu, lūdzu, sazinieties arBMKGENE eksperts
Pakalpojumu darba plūsma
Ietver šādu analīzi:
● Kvalitātes kontrole: šūnu skaits, gēnu noteikšana, precīza šūnu identifikācija, RNS molekulas un ekspresijas kvantitatīvā noteikšana
● Iekšējā parauga analīze:
Šūnu klasterizācija un klasteru anotācija
Diferenciālās izteiksmes analīze: DEG identificēšana klasteros
Klasteru DEG funkcionālā anotācija un bagātināšana
● Starpgrupu analīze:
Datu apvienošana
Diferenciālās ekspresijas analīze: DEG identificēšana grupās
Grupu DEG funkcionālā anotācija un bagātināšana
● Paplašinātā analīze:
Šūnu cikla analīze
Pseidotaika analīze
Šūnu komunikācijas analīze (CellPhoneDB)
Gēnu kopas bagātināšanas analīze (GSEA)
Iekšējā parauga analīze
Šūnu klasterizācija:
Diferenciālās izteiksmes analīze: klasteru DEG
Starpgrupu analīze
Diferenciālās izteiksmes analīze: grupas DEG
Paplašinātā analīze:
Pseidotaika analīze:
Šūnu cikla analīze:
Iepazīstieties ar sasniegumiem, ko veicinājuši BMKGene vienkodolu RNS sekvencēšanas pakalpojumi, izmantojot 10X Chromium, šajās ieteiktajās publikācijās:
Wang, L. et al. (2021) “Atsevišķu šūnu transkriptomiskā analīze atklāj plaušu imūno ainavu steroīdu rezistentas astmas saasinājuma gadījumā”,Amerikas Savienoto Valstu Nacionālās zinātņu akadēmijas raksti, 118(2), e2005590118. lpp. doi: 10.1073/pnas.2005590118
Zheng, H. et al. (2022) “Globāls regulējošais tīkls disregulētai gēnu ekspresijai un patoloģiskai vielmaiņas signalizācijai imūnās šūnās Greivsa slimības un Hašimoto tireoidīta mikrovidē”,Imunoloģijas robežas, 13, lpp. 879824. doi: 10.3389/FIMMU.2022.879824/BIBTEX.
Tian, H. et al. (2023) “Vienšūnu transkriptoms atklāj leikocītu heterogenitāti un imūnās atbildes pēc vakcinācijas ar inaktivētu Edwardsiella tarda plekstei (Paralichthys olivaceus)”,Akvakultūra, 566, 739238. lpp. doi: 10.1016/J.AQUACULTURE.2023.739238.
Yu, Y. et al. (2023) “Fotodinamiskā terapija uzlabo imūnās kontroles punktu inhibitoru rezultātus, pārveidojot pretvēža imunitāti pacientiem ar kuņģa vēzi”,Kuņģa vēzis, 26(5), 798.–813. lpp. doi: 10.1007/S10120-023-01409-X/METRICS.
