ТРАНСКРИПТОМИКА
природата
КОМУНИКАЦИИ
Карактеризацијата на транскриптот со целосна должина на мутацијата SF3B1 кај хронична лимфоцитна леукемија открива надолна регулација на задржаните интрони
Целосни преписи|Секвенционирање на нанопори|Алтернативна анализа на изоформи
Позадина
SОматските мутации во факторот за спојување SF3B1 е широко пријавено дека се поврзуваат со различни видови на рак, вклучувајќи хронична лимфоцитна леукемија (CLL), увеален меланом, рак на дојка, итн. Покрај тоа, краткотрајните транскриптомски студии открија аберантни шеми на спојување предизвикани од SF3B1 мутации.Сепак, студиите за овие алтернативни обрасци на спојување долго време се ограничени на ниво на настан и недостаток на знаење за ниво на изоформи поради ограничувањето на склопените транскрипти за кратко читање.Овде, беше воведена платформа за секвенционирање на нанопори за да се генерираат транскрипти со целосна должина, што го поттикна испитувањето на изоформите на AS.
Експериментален дизајн
Експерименти
Групирање:1. CLL-SF3B1(WT) 2. CLL-SF3B1(K700E мутација);3. Нормални Б-клетки
Стратегија за секвенционирање:Секвенционирање на библиотеката MinION 2D, секвенционирање на библиотеката PromethION 1D;кратко прочитани податоци од истите примероци
Платформа за секвенционирање:ONT MinION;ONT PromethION;
Биоинформатска анализа
Резултати
Авкупно 257 милиони читања беа генерирани од 6 CLL примероци и 3 Б-клетки.Во просек, 30,5% од овие читања беа идентификувани како целосни транскрипти.
FБеше развиена целосна алтернативна изоформна анализа на РНК (FLAIR) за да се генерираат збир на изоформи со висока доверба.FLAIR може да се сумира како:
Nанопор го чита порамнувањето: идентификувајте ја општата структура на препис врз основа на референтниот геном;
Sкорекција на раскрсницата на полите: поправете ги грешките во низата (црвено) со местото на спојување или од анотираните интрони, интроните од податоците за кратко читање или од двете;
Cпропаѓање: сумирајте ги репрезентативните изоформи засновани на синџири за спојување (множество со прво поминување).Изберете изод со висока доверба врз основа на бројот на придружни читања (праг: 3).
Слика 1. FLAIR анализа за да се идентификуваат изоформите со целосна големина поврзани со SF3B1 мутација во CLL
FLAIR Идентификувани 326.699 високодоверливи споени изоформи, од кои 90% се нови изоформи.Повеќето од овие необележани изоформи беа откриени дека се нови комбинации на познати спојки за спојување (142.971), додека останатите нови изоформи содржеа или задржан интрон (21.700) или нов егзон (3594).
Lсеквенците со долго читање овозможуваат идентификација на мутант SF3B1-K700E-променети места на спојување на ниво на изоформа.Беше откриено дека 35 алтернативни 3'SS и 10 алтернативни 5'SS се значително различно споени помеѓу SF3B1-K700E и SF3B1-WT.33 од 35-те измени беа новооткриени со долго прочитани секвенци.Во податоците на Nanopore, распределбата на растојанието помеѓу SF3B1-K700E-променетите 3'SS до врвовите на канонските локации е околу -20 bp, што значително се разликува од контролната дистрибуција, слично на она што е пријавено во секвенците за кратко читање на CLL.Беа анализирани изоформите на генот ERGIC3, каде што нова изоформа што го содржи проксималното спојување беше пронајдена пообилна во SF3B1-K700E.И проксималниот и дисталниот 3'SS беа поврзани со различни AS обрасци кои генерираат повеќе изоформи.
Слика 2. Алтернативни шеми на спојување 3' идентификувани со податоци за секвенционирање нанопори
Анализата за користење на IR настанот долго време беше ограничена во анализата базирана на кратко читање поради довербата во IR идентификацијата и квантификацијата.Изразот на IR изоформите во SF3B1-K700E и SF3B1-WT беа квантифицирани врз основа на секвенци на нанопори, откривајќи глобална надолна регулација на IR изоформите во SF3B1-K700E.
Слика 4. Интензитетот на земјоделството и мрежно поврзување низ три земјоделски системи (А и Б);Случајна анализа на шумите (C) и врска помеѓу земјоделскиот интензитет и колонизацијата на АМФ (Д)
Слика 3. Настаните за задржување на интроните се посилно намалени во CLL SF3B1-K700E
Технологија
Долгочитано секвенционирање на нанопори
Nанопорното секвенционирање е технологија за секвенционирање на електрични сигнали со една молекула во реално време.
Dдвоверижна ДНК или РНК ќе се поврзе со нанопорозниот протеин вграден во биофилмот и ќе се одмотува под водството на моторниот протеин.
DNA/RNA нишките поминуваат низ протеинот на нанопорниот канал со одредена брзина под дејство на напонската разлика.
Mолекулите генерираат различни електрични сигнали според хемиската структура.
RОткривањето на секвенците во реално време се постигнува со повикување на базата.
Изведба на секвенционирање на транскриптом со целосна должина
√ Заситеност на податоци
Потребни се 7 пати помалку читања за да се постигне споредлива заситеност на податоците.
√ Идентификација на структурата на препис
Идентификување на различни структурни варијанти со консензус целосно читање на секој препис
√ Диференцијална анализа на ниво на препис - Откријте ги промените скриени со кратки читања
Референца
Танг АД, Солет ЦМ, Барен МЈВ и др.Карактеризирањето на транскриптот со целосна должина на мутацијата на SF3B1 кај хроничната лимфоцитна леукемија открива надолна регулација на задржаните интрони [J].Природа комуникации.
Техника и Определување има за цел споделување на најновата успешна примена на различни технологии за секвенционирање со висок пропуст во различни истражувачки арени, како и брилијантни идеи за експериментален дизајн и ископување податоци.
Време на објавување: јануари-08-2022 година