Penjujukan mRNA penuh -PacBio

De novopenjujukan transkriptom penuh, juga dikenali sebagaiDe novoIso-Seq mengambil kelebihan penjujukan PacBio dalam panjang bacaan, yang membolehkan penjujukan molekul cDNA penuh panjang tanpa sebarang patah.Ini benar-benar mengelakkan sebarang ralat yang dijana dalam langkah pemasangan transkrip dan membina set unigene dengan resolusi tahap isoform.Set unigene ini menyediakan maklumat genetik yang berkuasa sebagai "genom rujukan" pada peringkat transkriptom.Selain itu, menggabungkan dengan data penjujukan generasi akan datang, perkhidmatan ini memperkasakan kuantifikasi yang tepat bagi ekspresi peringkat isoform.

Platform： PacBio Sequel II

Perpustakaan: perpustakaan loceng SMRT

Hubungi Kami

Butiran Perkhidmatan

Keputusan Demo

Kajian kes

Kelebihan Perkhidmatan

● Bacaan terus molekul cDNA penuh dari 3'- hujung hingga 5'- hujung

● Resolusi tahap bentuk iso dalam struktur jujukan

● Transkrip dengan ketepatan dan integriti yang tinggi

● Sangat serasi dengan spesies vaiours

● Kapasiti penjujukan yang besar dengan 4 platform penjujukan PacBio Sequel II dilengkapi

● Sangat berpengalaman dengan lebih 700 projek penjujukan RNA berasaskan Pacbio

● Penghantaran hasil berasaskan BMKCloud: Perlombongan data tersuai tersedia pada platform.

● Perkhidmatan selepas jualan sah selama 3 bulan selepas projek siap

Spesifikasi Perkhidmatan

Platform: PacBio Sequel II

Pustaka penjujukan: Pustaka mRNA yang diperkayakan Poli A

Hasil data yang disyorkan: 20 Gb/sampel (Bergantung pada spesies)

FLNC（%）： ≥75%

*FLNC: Transip bukan chimeric penuh panjang

Analisis bioinformatik

● Pemprosesan data mentah

● Pengenalan transkrip

● Struktur jujukan

● Kuantifikasi Ungkapan

● Anotasi Fungsi

Keperluan Sampel dan Penghantaran

Keperluan Sampel:

Nukleotida:

Conc.(ng/μl)

Jumlah (μg)

Kesucian

Integriti

≥ 120

≥ 0.6

OD260/280=1.7-2.5

OD260/230=0.5-2.5

Pencemaran protein atau DNA terhad atau tiada ditunjukkan pada gel.

Untuk tumbuhan: RIN≥7.5;

Untuk haiwan: RIN≥8.0;

5.0≥ 28S/18S≥1.0;

terhad atau tiada ketinggian garis dasar

Tisu: Berat (kering):≥1 g
*Untuk tisu yang lebih kecil daripada 5 mg, kami mengesyorkan untuk menghantar sampel tisu beku kilat (dalam nitrogen cecair).

Penggantungan sel:Bilangan sel = 3×10⁶- 1×10⁷
*Kami mengesyorkan untuk menghantar lisat sel beku.Sekiranya bilangan sel itu lebih kecil daripada 5×10⁵, kilat beku dalam nitrogen cecair adalah disyorkan, yang lebih baik untuk pengekstrakan mikro.

Sampel darah:Isipadu≥1 mL

Mikroorganisma:Jisim ≥ 1 g

Penghantaran Sampel yang Disyorkan

Bekas:
2 ml tiub empar (Kerajang timah tidak disyorkan)
Pelabelan sampel: Kumpulan+replikasi cth A1, A2, A3;B1, B2, B3... ...

Penghantaran:

1. Ais kering: Sampel perlu dibungkus dalam beg dan dikebumikan dalam ais kering.
2. Tiub RNAstable: Sampel RNA boleh dikeringkan dalam tiub penstabilan RNA (cth RNAstable®) dan dihantar dalam suhu bilik.

Aliran Kerja Perkhidmatan

Reka bentuk eksperimen

Contoh penghantaran

Pengekstrakan RNA

Pembinaan perpustakaan

Sequencing

Analisis data

Perkhidmatan selepas jualan

Sebelumnya: Penjujukan mRNA Eukariotik-Illumina

Seterusnya: Penjujukan mRNA Penuh-Nanopore

1.Pengagihan panjang FLNC

Panjang bacaan bukan chimeric (FLNC) penuh panjang menunjukkan panjang cDNA dalam pembinaan perpustakaan.Pengagihan panjang FLNC adalah penunjuk penting dalam menilai kualiti pembinaan perpustakaan.

mRNA-FLNC-read-length-distribution

Taburan panjang baca FLNC

2.Taburan panjang wilayah ORF lengkap

Kami menggunakan TransDecoder untuk meramalkan kawasan pengekodan protein dan jujukan asid amino yang sepadan untuk menjana set unigene, yang mengandungi maklumat transkrip tidak berlebihan yang lengkap dalam semua sampel.

mRNA-Lengkap-ORF-pengedaran-panjang

Taburan panjang wilayah ORF lengkap

3.Analisis pengayaan laluan KEGG

Transkrip yang dinyatakan secara berbeza (DET) boleh dikenal pasti dengan menjajarkan data penjujukan RNA berasaskan NGS pada set transkrip panjang penuh yang dijana oleh data penjujukan PacBio.DET ini boleh diproses selanjutnya untuk pelbagai analisis fungsi, contohnya analisis pengayaan laluan KEGG.

mRNA-DEG-KEGG-pengayaan-laluan

Pengayaan laluan DET KEGG -Plot titik

Kes BMK

Dinamika perkembangan transkriptom batang Populus

Diterbitkan: Jurnal Bioteknologi Tumbuhan, 2019

Strategi urutan:
Koleksi sampel:kawasan batang: puncak, ruas pertama(IN1), ruas kedua(IN2), ruas ketiga(IN3), ruas(IN4) dan ruas(IN5) daripada Nanlin895
Urutan NGS:RNA daripada 15 individu telah dikumpulkan sebagai satu sampel biologi.Tiga replika biologi setiap titik telah diproses untuk urutan NGS
TGS-jujukan:Kawasan batang dibahagikan kepada tiga kawasan, iaitu puncak, IN1-IN3 dan IN4-IN5.Setiap rantau telah diproses untuk penjujukan PacBio dengan empat jenis perpustakaan: 0-1 kb, 1-2 kb, 2-3 kb dan 3-10 kb.

Keputusan utama

1. Sebanyak 87150 transkrip panjang penuh telah dikenalpasti, di mana, 2081 isoform novel dan 62058 isoform bersambung alternatif novel telah dikenalpasti.
2.1187 lncRNA dan 356 gen gabungan telah dikenalpasti.
3. Daripada pertumbuhan primer kepada pertumbuhan sekunder, 15838 transkrip yang dinyatakan secara berbeza daripada 995 gen yang dinyatakan secara berbeza telah dikenalpasti.Dalam semua DEG, 1216 adalah faktor transkripsi, yang kebanyakannya belum dilaporkan.
4. Analisis pengayaan GO mendedahkan kepentingan pembahagian sel dan proses pengurangan pengoksidaan dalam pertumbuhan primer dan sekunder.