Penjujukan mRNA Penuh-Nanopore
Kelebihan Perkhidmatan
● Pincang jujukan rendah
● Mendedahkan molekul cDNA penuh
● Kurang data yang diperlukan untuk menampung bilangan transkrip yang sama
● Pengenalpastian pelbagai isoform bagi setiap gen
● Kuantifikasi ungkapan dalam tahap isoform
Spesifikasi Perkhidmatan
| Perpustakaan | Platform | Hasil data yang disyorkan (Gb) | Kawalan kualiti |
| cDNA-PCR(Poly-A diperkaya) | Nanopore PromethION P48 | 6 Gb/sampel (Bergantung pada spesies) | Nisbah panjang penuh＞70% Purata skor kualiti: S10
|
Analisis bioinformatik
●Pemprosesan data mentah
● Pengenalan transkrip
● Penyambungan alternatif
● Kuantifikasi ekspresi dalam tahap gen dan tahap isoform
● Analisis ungkapan perbezaan
● Anotasi dan pengayaan fungsi (DEG dan DET)
Keperluan Sampel dan Penghantaran
Keperluan Sampel:
Nukleotida:
| Conc.(ng/μl) | Jumlah (μg) | Kesucian | Integriti |
| ≥ 100 | ≥ 0.6 | OD260/280=1.7-2.5 OD260/230=0.5-2.5 Pencemaran protein atau DNA terhad atau tiada ditunjukkan pada gel. | Untuk tumbuhan: RIN≥7.0; Untuk haiwan: RIN≥7.5; 5.0≥28S/18S≥1.0; terhad atau tiada ketinggian garis dasar |
Tisu: Berat (kering): ≥1 g
*Untuk tisu yang lebih kecil daripada 5 mg, kami mengesyorkan untuk menghantar sampel tisu beku kilat (dalam nitrogen cecair).
Penggantungan sel: Kiraan sel = 3×106- 1×107
*Kami mengesyorkan untuk menghantar lisat sel beku.Sekiranya bilangan sel itu lebih kecil daripada 5×105, kilat beku dalam nitrogen cecair adalah disyorkan, yang lebih baik untuk pengekstrakan mikro.
Sampel darah: Isipadu≥1 ml
Penghantaran Sampel yang Disyorkan
Bekas: 2 ml tiub empar (Kerajang timah tidak disyorkan)
Pelabelan sampel: Kumpulan+replikasi cth A1, A2, A3;B1, B2, B3... ...
Penghantaran: 2、Ais kering: Sampel perlu dibungkus dalam beg dan dikebumikan dalam ais kering.
- Tiub RNAstable: Sampel RNA boleh dikeringkan dalam tiub penstabilan RNA (cth RNAstable®) dan dihantar dalam suhu bilik.
Aliran Kerja Perkhidmatan
Nukleotida:
Contoh penghantaran
Pembinaan perpustakaan
Sequencing
Analisis data
Perkhidmatan selepas jualan
Aliran Kerja Perkhidmatan
Tisu:
Reka bentuk eksperimen
Contoh penghantaran
Pengekstrakan RNA
Pembinaan perpustakaan
Sequencing
Analisis data
Perkhidmatan selepas jualan
1.Analisis ekspresi berbeza -Plot gunung berapi
Analisis ekspresi pembezaan boleh diproses dalam kedua-dua peringkat gen untuk mengenal pasti gen yang dinyatakan secara berbeza (DEG) dan dalam tahap isoform untuk mengenal pasti secara berbeza.
transkrip yang dinyatakan (DET)
2.Peta haba pengelompokan hierarki
3.Pengenalan dan pengelasan penyambungan alternatif
Lima jenis peristiwa penyambungan alternatif boleh diramalkan oleh Astalavista.
4.Pengenalpastian dan Motif peristiwa poli-adenilasi (APA) alternatif pada 50 bp hulu poli-A
Kes BMK
Pengenalpastian penyambungan alternatif dan kuantifikasi tahap isoform oleh penjujukan transkriptom penuh nanopore
Diterbitkan:Komunikasi Alam Semula Jadi,2020
Strategi urutan:
Pengelompokan: 1. CLL-SF3B1(WT);2. CLL-SF3B1(mutasi K700E);3. Sel B biasa
Strategi penjujukan: Penjujukan perpustakaan Minion 2D, penjujukan perpustakaan PromethION 1D;data bacaan pendek daripada sampel yang sama
Platform penjujukan: Nanopore Minion;Nanopore PromethION;
Keputusan utama
1.Pengenalpastian Penyambung Alternatif peringkat isoform
Urutan yang dibaca lama memperkasakan pengenalpastian SF3B1 mutanK700E-tapak splice yang diubah pada tahap isoform.35 alternatif 3'SSs dan 10 alternatif 5'SSs didapati mempunyai perbezaan yang ketara antara SF3B1K700Edan SF3B1WT.33 daripada 35 perubahan itu baru ditemui oleh urutan yang dibaca lama.
2.Kuantiti Penyambungan Alternatif peringkat isoform
Ungkapan isoform pengekalan intron(IR) dalam SF3B1K700Edan SF3B1WTtelah dikira berdasarkan jujukan nanopore, mendedahkan peraturan turun global isoform IR dalam SF3B1K700E.
Rujukan
Tang AD , Soulette CM , Baren MJV , et al.Pencirian transkrip penuh mutasi SF3B1 dalam leukemia limfositik kronik mendedahkan penurunan regulasi intron yang dikekalkan [J].Komunikasi Alam Semula Jadi.
