အစအဆုံး mRNA စီစစ်ခြင်း -PacBio
ဝန်ဆောင်မှု အားသာချက်များ
● 3'- အဆုံးမှ 5'- အဆုံးအထိ cDNA မော်လီကျူး၏ အစအဆုံး တိုက်ရိုက်ဖတ်ခြင်း
● အစီအစဥ်ဖွဲ့စည်းပုံတွင် Iso-form အဆင့် ကြည်လင်ပြတ်သားမှု
● တိကျမှုနှင့် ခိုင်မာမှုရှိသော စာသားမှတ်တမ်းများ
● vaiour မျိုးစိတ်များနှင့် အလွန်လိုက်ဖက်သည်။
● တပ်ဆင်ထားသော PacBio Sequel II sequencing platform 4 ခုပါရှိသော ကြီးမားသော sequencing စွမ်းရည်
● Pacbio-based RNA sequencing ပရောဂျက်ပေါင်း 700 ကျော်ဖြင့် အတွေ့အကြုံကောင်း
● BMKCloud အခြေခံရလဒ်ပေးပို့ခြင်း- ပလပ်ဖောင်းပေါ်တွင် စိတ်ကြိုက်ဒေတာတူးဖော်ခြင်း
● ပရောဂျက်ပြီးဆုံးချိန်တွင် အရောင်းအပြီးဝန်ဆောင်မှုများသည် ၃ လ သက်တမ်းရှိသည်။
ဝန်ဆောင်မှုသတ်မှတ်ချက်များ
ပလပ်ဖောင်း- PacBio Sequel II
Sequencing စာကြည့်တိုက်- Poly A- ကြွယ်ဝသော mRNA စာကြည့်တိုက်
အကြံပြုထားသည့် ဒေတာအထွက်နှုန်း- 20 Gb/နမူနာ (မျိုးစိတ်ပေါ်မူတည်၍)
FLNC (%): ≥75%
*FLNC- စာသားမဟုတ်သော စာသားအပြည့်အစုံ
Bioinformatics ပိုင်းခြားစိတ်ဖြာချက်များ
● အကြမ်းထည်ဒေတာကို လုပ်ဆောင်ခြင်း။
● စာသားမှတ်တမ်း အထောက်အထား
● တစ်ဆက်တည်း ဖွဲ့စည်းပုံ
● Expression Quantification
● လုပ်ဆောင်ချက် မှတ်ချက်
နမူနာလိုအပ်ချက်များနှင့် ပေးပို့ခြင်း။
နမူနာလိုအပ်ချက်များ-
Nucleotides-
| Conc.(ng/μl) | ပမာဏ (μg) | သန့်ရှင်းစင်ကြယ်ခြင်း။ | သမာဓိ |
| ≥ ၁၂၀ | ≥ 0.6 | OD260/280=1.7-2.5 OD260/230=0.5-2.5 ဂျယ်တွင်ပြသထားသော ပရိုတင်း သို့မဟုတ် DNA ညစ်ညမ်းမှု အကန့်အသတ် သို့မဟုတ် မရှိပါ။ | အပင်များအတွက် RIN≥7.5; တိရစ္ဆာန်များအတွက် RIN≥8.0; 5.0≥ 28S/18S≥1.0; အကန့်အသတ် သို့မဟုတ် အခြေခံအဆင့်မြင့်ခြင်း |
တစ်ရှူး- အလေးချိန် (အခြောက်)≥1 ဂရမ်
* 5 မီလီဂရမ်ထက်သေးငယ်သောတစ်ရှူးအတွက်၊ ဖလက်ရှ်အေးခဲထားသော (နိုက်ထရိုဂျင်အရည်တွင်) တစ်ရှူးနမူနာကို ပေးပို့ရန် အကြံပြုအပ်ပါသည်။
ဆဲလ်ဆိုင်းငံ့မှု-ဆဲလ်အရေအတွက် = 3×106- 1×107
* အေးခဲနေသောဆဲလ် lysate ကိုတင်ပို့ရန်ကျွန်ုပ်တို့အကြံပြုပါသည်။ဆဲလ်သည် 5×10 ထက်ငယ်ပါက ရေတွက်ပါ။5နိုက်ထရိုဂျင်အရည်တွင် အေးခဲထားသည့် flash ကို မိုက်ခရိုထုတ်ယူမှုအတွက် ပိုကောင်းသည်ဟု အကြံပြုထားသည်။
သွေးနမူနာများပမာဏ≥1 mL
သေးငယ်သောဇီဝသက်ရှိ-ထုထည် ≥ 1 ဂရမ်
နမူနာပေးပို့မှု အကြံပြုထားသည်။
ကွန်တိန်နာ-
2 ml centrifuge tube (Tin foil ကို မထောက်ခံပါ)
နမူနာတံဆိပ်ကပ်ခြင်း- အုပ်စု+ဥပမာ A1၊ A2၊ A3၊B1၊ B2၊ B3 ......
တင်ပို့မှု-
1. ရေခဲခြောက်- နမူနာများကို အိတ်များတွင်ထုပ်ပိုးပြီး ရေခဲခြောက်ထဲတွင် မြှုပ်ထားရန် လိုအပ်သည်။
2. RNAstable tubes- RNA နမူနာများကို RNA stabilization tube (ဥပမာ RNAstable®) တွင် အခြောက်ခံပြီး အခန်းအပူချိန်တွင် တင်ပို့နိုင်ပါသည်။
Service Work Flow
စမ်းသပ်ထားတာ
နမူနာပေးပို့ခြင်း။
RNA ထုတ်ယူခြင်း။
စာကြည့်တိုက်တည်ဆောက်ရေး
Sequencing
ဒေတာခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာ
ရောင်းချပြီးနောက်ဝန်ဆောင်မှုများ
1.FLNC အရှည် ဖြန့်ချီရေး
စာကြည့်တိုက်တည်ဆောက်မှုတွင် cDNA ၏အရှည်ကို ဖော်ပြသော အရှည်-chimeric မဟုတ်သော ဖတ်ရှုခြင်း(FLNC) ၏ အရှည်။FLNC အရှည်ဖြန့်ဝေမှုသည် စာကြည့်တိုက်တည်ဆောက်မှုအရည်အသွေးကို အကဲဖြတ်ရာတွင် အရေးကြီးသောညွှန်ပြချက်တစ်ခုဖြစ်သည်။
FLNC ၏ အရှည် ဖြန့်ချီရေး
2.Complete ORF ဒေသ အရှည် ဖြန့်ဖြူးခြင်း။
ကျွန်ုပ်တို့သည် ပရိုတိန်းကုဒ်ရေးသည့်ဒေသများနှင့် သက်ဆိုင်သောအမိုင်နိုအက်ဆစ်အစီအစဉ်များကို ခန့်မှန်းရန် TransDecoder ကိုအသုံးပြုပြီး နမူနာအားလုံးတွင် မလိုအပ်သော စာသားမှတ်တမ်းအချက်အလက်အပြည့်အစုံပါရှိသော unigene sets များကိုထုတ်လုပ်ရန် ကျွန်ုပ်တို့အသုံးပြုပါသည်။
ORF ဒေသ အရှည် ဖြန့်ချီရေး အပြီးသတ်ပါ။
3.KEGG လမ်းကြောင်း ကြွယ်ဝမှု ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း။
PacBio sequencing data မှထုတ်ပေးသည့် အရှည်လျားသော စာသားမှတ်တမ်းအတွဲများပေါ်တွင် NGS-based RNA စီစစ်ခြင်းဒေတာကို ချိန်ညှိခြင်းဖြင့် ကွဲပြားစွာဖော်ပြသောစာသားများ(DETs) ကို ဖော်ထုတ်နိုင်ပါသည်။ဤ DET များသည် အမျိုးမျိုးသော လုပ်ဆောင်ချက်ဆိုင်ရာ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက် ထပ်မံလုပ်ဆောင်နိုင်သည်၊ ဥပမာ KEGG လမ်းကြောင်း ကြွယ်ဝမှု ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း။
DET KEGG လမ်းကြောင်း ကြွယ်ဝမှု -Dot ကွက်
BMK ဖြစ်ရပ်မှန်
Populus stem transcriptome ၏ ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှု ဒိုင်းနမစ်များ
ထုတ်ဝေသည်- အပင်ဇီဝနည်းပညာဂျာနယ်2019 ခုနှစ်
ဆင့်ကဲနည်းဗျူဟာ-
နမူနာစုစည်းမှု-ပင်စည်ဒေသများ- အထွတ်၊ ပထမအင်တာနက်(IN1)၊ ဒုတိယအင်တာနက်(IN2)၊ တတိယအင်တာနက်(IN3)၊ နန်လင်း၈၉၅ မှ အင်တာနော့ဒ်(IN4)နှင့် အင်တာနက်(IN5)
NGS အဆင့်-လူ ၁၅ ဦး၏ RNA ကို ဇီဝနမူနာတစ်ခုအဖြစ် ပေါင်းစပ်ထားသည်။NGS အစီအစဥ်အတွက် အမှတ်တစ်ခုစီ၏ ဇီဝပုံတူပွားသုံးမျိုးကို လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။
TGS အမျိုးအစား-ပင်မဒေသများကို အထွတ်၊ IN1-IN3 နှင့် IN4-IN5 ဟူ၍ အပိုင်းသုံးပိုင်းခွဲထားသည်။0-1 kb၊ 1-2 kb၊ 2-3 kb နှင့် 3-10 kb စာကြည့်တိုက်လေးမျိုးဖြင့် PacBio စီစီခြင်းအတွက် ဒေသတစ်ခုစီကို စီမံဆောင်ရွက်ထားပါသည်။
အဓိကရလဒ်များ
1. စုစုပေါင်း 87150 ကို အစအဆုံး စာသားမှတ်တမ်းများကို ဖော်ထုတ်ခဲ့ပြီး၊ ယင်းတွင် ဝတ္ထု 2081 ခုနှင့် ပေါင်းစပ်ထားသော ခြားနားချက် 62058 ဝတ္ထုတို့ကို ဖော်ထုတ်ခဲ့သည်။
2.1187 lncRNA နှင့် ပေါင်းစပ်ဗီဇ 356 ကို ဖော်ထုတ်ခဲ့သည်။
3. မူလကြီးထွားမှုမှ ဒုတိယကြီးထွားမှုအထိ၊ ကွဲပြားစွာဖော်ပြသောဗီဇ 995 ခုမှ 15838 ကွဲပြားစွာဖော်ပြသောမှတ်တမ်းများကို ဖော်ထုတ်ခဲ့သည်။DEG များအားလုံးတွင် 1216 သည် စာသားမှတ်တမ်းအချက်များဖြစ်ပြီး အများစုမှာ အစီရင်ခံခြင်းမရှိသေးပါ။
4.GO ကြွယ်ဝမှုဆိုင်ရာ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုသည် မူလနှင့် ဒုတိယကြီးထွားမှုတွင် ဆဲလ်ခွဲဝေမှုနှင့် ဓာတ်တိုးမှုလျှော့ချရေးလုပ်ငန်းစဉ်များ၏ အရေးပါမှုကို ဖော်ပြခဲ့သည်။
အစားထိုး ပေါင်းစည်းခြင်း ဖြစ်ရပ်များနှင့် မတူညီသော isoform များ
ကူးယူဖော်ပြခြင်းဆိုင်ရာ အချက်များအပေါ် WGCNA ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း။
အကိုးအကား
Chao Q၊ Gao ZF၊ Zhang D၊ et al။Populus stem transcriptome ၏ ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှု ဒိုင်းနမစ်များ။အပင်ဇီဝနည်းပညာ J. 2019;17(1):206-219။doi-10.1111/pbi.12958
