အကိုးအကားမရှိသော mRNA Sequencing-Illumina
အင်္ဂါရပ်များ
● မည်သည့်ရည်ညွှန်းဂျီနိုမ်၏ သီးခြား၊
● စာသားမှတ်တမ်းများ၏ တည်ဆောက်ပုံနှင့် ဖော်ပြချက်တို့ကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာရန် ဒေတာကို အသုံးပြုနိုင်သည်။
● ပြောင်းလဲနိုင်သော ညှပ်ဆိုဒ်များကို ခွဲခြားသတ်မှတ်ပါ။
ဝန်ဆောင်မှု အားသာချက်များ
● BMKCloud အခြေပြုရလဒ်ပေးပို့ခြင်း- ရလဒ်များကို ဒေတာဖိုင်နှင့် အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုအစီရင်ခံစာအဖြစ် BMKCloud ပလပ်ဖောင်းမှတစ်ဆင့် ပေးပို့သည်၊ ၎င်းသည် ရှုပ်ထွေးသောခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုရလဒ်များကို အသုံးပြုသူများအဆင်ပြေစွာဖတ်ရှုနိုင်စေရန်နှင့် စံဇီဝနည်းပညာဆိုင်ရာခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကိုအခြေခံ၍ စိတ်ကြိုက်ဒေတာတူးဖော်ခြင်းကို ခွင့်ပြုပါသည်။
● ရောင်းပြီးနောက်ပိုင်းဝန်ဆောင်မှုများ- ပရောဂျက်များနောက်ဆက်တွဲ၊ ပြဿနာဖြေရှင်းခြင်း၊ ရလဒ်များ အမေးအဖြေစသည်ဖြင့် ပရောဂျက်ပြီးဆုံးချိန်တွင် 3 လအထိ သက်တမ်းရှိသော ဝန်ဆောင်မှုများ။
နမူနာလိုအပ်ချက်များနှင့် ပေးပို့ခြင်း။
နမူနာလိုအပ်ချက်များ-
Nucleotides-
| Conc.(ng/μl) | ပမာဏ (μg) | သန့်ရှင်းစင်ကြယ်ခြင်း။ | သမာဓိ |
| ≥ ၂၀ | ≥ 0.5 | OD260/280=1.7-2.5 OD260/230=0.5-2.5 ဂျယ်တွင်ပြသထားသော ပရိုတင်း သို့မဟုတ် DNA ညစ်ညမ်းမှု အကန့်အသတ် သို့မဟုတ် မရှိပါ။ | အပင်များအတွက် RIN≥6.5; တိရစ္ဆာန်များအတွက် RIN≥7.0; 5.0≥28S/18S≥1.0; အကန့်အသတ် သို့မဟုတ် အခြေခံအဆင့်မြင့်ခြင်း |
တစ်ရှူး- အလေးချိန် (အခြောက်) ≥1 ဂရမ်
* 5 မီလီဂရမ်ထက်သေးငယ်သောတစ်ရှူးအတွက်၊ ဖလက်ရှ်အေးခဲထားသော (နိုက်ထရိုဂျင်အရည်တွင်) တစ်ရှူးနမူနာကို ပေးပို့ရန် အကြံပြုအပ်ပါသည်။
ဆဲလ်ဆိုင်းငံ့မှု- ဆဲလ်အရေအတွက် = 3×107
* အေးခဲနေသောဆဲလ် lysate ကိုတင်ပို့ရန်ကျွန်ုပ်တို့အကြံပြုပါသည်။ဆဲလ်သည် 5×10 ထက်ငယ်ပါက ရေတွက်ပါ။5နိုက်ထရိုဂျင် အရည်တွင် အေးခဲနေသော flash ကို အကြံပြုထားသည်။
သွေးနမူနာများ
PA×geneBloodRNATube;
6mLTRIzol နှင့် 2mL သွေး (TRIzol: သွေး = 3:1)
နမူနာပေးပို့မှု အကြံပြုထားသည်။
ကွန်တိန်နာ-
2 ml centrifuge tube (Tin foil ကို မထောက်ခံပါ)
နမူနာတံဆိပ်ကပ်ခြင်း- အုပ်စု+ဥပမာ A1၊ A2၊ A3၊B1၊ B2၊ B3 ......
တင်ပို့မှု-
1.Dry-ice- နမူနာများကို အိတ်များတွင်ထုပ်ပိုးပြီး ရေခဲခြောက်ထဲတွင် မြှုပ်ထားရန် လိုအပ်သည်။
2.RNAstable tubes- RNA နမူနာများကို RNA stabilization tube (ဥပမာ RNAstable®) တွင် အခြောက်ခံပြီး အခန်းအပူချိန်တွင် တင်ပို့နိုင်ပါသည်။
Service Work Flow
စမ်းသပ်ထားတာ
နမူနာပေးပို့ခြင်း။
RNA ထုတ်ယူခြင်း။
စာကြည့်တိုက်တည်ဆောက်ရေး
Sequencing
ဒေတာခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာ
ရောင်းချပြီးနောက်ဝန်ဆောင်မှုများ
ဇီဝအချက်အလက်
1.mRNA(denovo) စည်းဝေးပွဲဆိုင်ရာ မူဝါဒ
သုံးပါးပေါင်းတစ်ဆူအားဖြင့်၊ ဖတ်ရှုမှုများကို K-mer ဟုခေါ်သော သေးငယ်သောအပိုင်းများအဖြစ် အပိုင်းပိုင်းခွဲထားသည်။ထို့နောက် ဤ K-mers များကို contig များအဖြစ်သို့တိုးချဲ့ရန်နှင့် contig overlaps များကိုအခြေခံ၍ အစိတ်အပိုင်းအဖြစ်အသုံးပြုသည်။နောက်ဆုံးတွင်၊ De Bruijn သည် အစိတ်အပိုင်းများရှိ စာသားမှတ်တမ်းများကို အသိအမှတ်ပြုရန် ဤနေရာတွင် အသုံးပြုခဲ့သည်။
mRNA (De novo) သုံးပါးတစ်ဆူ၏ ခြုံငုံသုံးသပ်ချက်
2.mRNA (De novo) Gene Expression Level ကို ဖြန့်ဝေခြင်း။
RNA-Seq သည် မျိုးဗီဇဖော်ပြမှု၏ အလွန်အကဲဆတ်သော ခန့်မှန်းချက်တစ်ခုကို ရရှိနိုင်သည်။ပုံမှန်အားဖြင့်၊ တွေ့ရှိနိုင်သော စာသားဖော်ပြချက် FPKM ၏ အကွာအဝေးသည် 10^-2 မှ 10^6 အထိဖြစ်သည်။
mRNA (De novo) နမူနာတစ်ခုစီတွင် FPKM သိပ်သည်းဆကို ဖြန့်ဝေခြင်း။
3.mRNA (De novo) GO ကြွယ်ဝမှု ဆန်းစစ်ခြင်း DEGs
GO (Gene Ontology) ဒေတာဘေ့စ်သည် မျိုးရိုးဗီဇနှင့် ဗီဇထုတ်ကုန်များဆိုင်ရာ စံဝေါဟာရတစ်ခုပါရှိသော ဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ထားသော ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာမှတ်ချက်စနစ်တစ်ခုဖြစ်သည်။၎င်းတွင် အဆင့်များစွာပါဝင်ပြီး အဆင့်နိမ့်လေ၊ လုပ်ဆောင်ချက်များ ပိုမိုတိကျလေဖြစ်သည်။
mRNA (De novo) GO ၏ ဒုတိယအဆင့်တွင် DEGs အမျိုးအစားခွဲခြားခြင်း။
BMK ဖြစ်ရပ်မှန်
ကြက်သွန်နီတွင် မီးသီးများ ရောင်ရမ်းခြင်းနှင့် ဖွံ့ဖြိုးလာစဉ် Sucrose ဇီဝဖြစ်စဉ်ဆိုင်ရာ စာသားမှတ်တမ်းကို လေ့လာခြင်း (Allium cepa L.)
ထုတ်ဝေသည်- အပင်သိပ္ပံနယ်ပယ်၊ ၂၀၁၆
Sequence ဗျူဟာ
Illumina HiSeq2500
နမူနာစုစည်းမှု
Utah အဝါရောင်မွှေးစပိန်မျိုးစိတ် “Y1351” ကို ဤလေ့လာမှုတွင် အသုံးပြုခဲ့သည်။နမူနာ အရေအတွက် ကောက်ယူခဲ့တာ ဖြစ်ပါတယ်။
မီးသီးရောင်ခြင်း (DAS) (2 စင်တီမီတာအချင်းနှင့် 3-4 ဂရမ်အလေးချိန်)၊ 30th DAS (5-စင်တီမီတာအချင်းနှင့် 100-110 ဂရမ်အလေးချိန်)၊ နှင့် 40th DAS (7-စင်တီမီတာအချင်းနှင့် ∼3)၊ 260-300 ဂရမ်။
အဓိကရလဒ်များ
1. Venn diagram တွင်၊ စုစုပေါင်း 146 DEG များကို ဖွံ့ဖြိုးမှုအဆင့် အတွဲသုံးတွဲစလုံးတွင် တွေ့ရှိခဲ့သည်
2.“ကာဗိုဟိုက်ဒရိတ် သယ်ယူပို့ဆောင်ရေးနှင့် ဇီဝြဖစ်ပျက်မှု” ကို ယူနီဂျင် 585 (ဆိုလိုသည်မှာ အမှတ်အသားပြု COG ၏ 7%) ကိုသာ ကိုယ်စားပြုသည်။
3.Unigenes သည် GO ဒေတာဘေ့စ်တွင် အောင်မြင်စွာ မှတ်သားထားသော မီးသီးဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှု အဆင့်သုံးဆင့်အတွက် အဓိကအမျိုးအစားသုံးမျိုး ခွဲခြားထားသည်။“ဇီဝဖြစ်စဉ်” ၏ အဓိကအမျိုးအစားတွင် ကိုယ်စားပြုအများစုမှာ “ဇီဝဖြစ်စဉ်ဖြစ်စဉ်” ဖြစ်ပြီး၊ နောက်တွင် “ဆဲလ်လူလာဖြစ်စဉ်” ဖြစ်သည်။“မော်လီကျူးလုပ်ဆောင်ချက်” ၏ အဓိကအမျိုးအစားတွင် အများဆုံးကိုယ်စားပြုသည့် အမျိုးအစားနှစ်ခုမှာ “binding” နှင့် “catalytic activity” ဖြစ်သည်။
 orthologous အုပ်စုများ (COG) အမျိုးအစားခွဲခြင်း၏ ဟစ်စတိုဂရမ် |  ဖွံ့ဖြိုးမှုအဆင့်သုံးဆင့်တွင် မီးသီးများမှဆင်းသက်လာသော unigenes များအတွက် gene ontology (GO) ၏ Histogram အမျိုးအစားခွဲခြားခြင်း |
 ကြက်သွန်နီမီးသီး ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှု အဆင့်နှစ်ဆင့်တွင် ကွဲပြားစွာ ဖော်ပြထားသော မျိုးဗီဇများကို ပြသသည့် Venn ပုံကြမ်း |
အကိုးအကား
Zhang C၊ Zhang H၊ Zhan Z et al ။ကြက်သွန်နီတွင် မီးသီးများ ရောင်ရမ်းခြင်းနှင့် ဖွံ့ဖြိုးလာစဉ် Sucrose ဇီဝဖြစ်စဉ်ဆိုင်ရာ စာသားမှတ်တမ်းကို လေ့လာခြင်း (Allium cepa L.)[J]။Plant Science in Frontiers၊ 2016၊ 7:1425-။DOI- 10.3389/fpls.2016.01425
