Full-lengde mRNA-sekvensering -PacBio

De novofull-lengde transkriptomsekvensering, også kjent somDe novoIso-Seq tar fordelene med PacBio-sequencer i leselengde, som muliggjør sekvensering av cDNA-molekyler i full lengde uten pauser.Dette unngår fullstendig feil generert i transkripsjonsmonteringstrinn og konstruerer unigen sett med isoform-nivå oppløsning.Disse unigensettene gir kraftig genetisk informasjon som "referansegenom" på transkriptomnivå.I tillegg, i kombinasjon med neste generasjons sekvenseringsdata, gir denne tjenesten en nøyaktig kvantifisering av uttrykk på isoformnivå.

Plattform: PacBio Sequel II

Bibliotek: SMRT klokkebibliotek

Kontakt oss

Tjenestedetaljer

Demo resultater

Kasusstudie

Tjenestefordeler

● Direkte avlesning av cDNA-molekyl i full lengde fra 3'-ende til 5'-ende

● Iso-formnivåoppløsning i sekvensstruktur

● Transkripsjoner med høy nøyaktighet og integritet

● Svært kompatibel med vaiours arter

● Stor sekvenseringskapasitet med 4 PacBio Sequel II sekvenseringsplattformer utstyrt

● Svært erfaren med over 700 Pacbio-baserte RNA-sekvenseringsprosjekter

● BMKCloud-basert resultatlevering: Tilpasset datautvinning tilgjengelig på plattformen.

● Ettersalgstjenester gyldig i 3 måneder etter ferdigstillelse av prosjektet

Tjenestespesifikasjoner

Plattform: PacBio Sequel II

Sekvenseringsbibliotek: Poly A-anriket mRNA-bibliotek

Anbefalt datautbytte: 20 Gb/prøve (avhengig av art)

FLNC（%）： ≥75%

*FLNC: Ikke-kimeriske transsipter i full lengde

Bioinformatikkanalyser

● Behandling av rådata

● Transkripsjonsidentifikasjon

● Sekvensstruktur

● Kvantifisering av uttrykk

● Funksjonsanmerkning

Prøvekrav og levering

Eksempelkrav:

Nukleotider:

Kons.(ng/μl)

Mengde (μg)

Renhet

Integritet

≥ 120

≥ 0,6

OD260/280=1,7-2,5

OD260/230=0,5-2,5

Begrenset eller ingen protein- eller DNA-kontaminering vist på gel.

For planter: RIN≥7,5;

For dyr: RIN≥8,0;

5,0≥ 28S/18S≥1,0;

begrenset eller ingen grunnlinjehøyde

Vev: Vekt (tørr):≥1 g
*For vev mindre enn 5 mg anbefaler vi å sende hurtigfrosset (i flytende nitrogen) vevsprøve.

Cellesuspensjon:Celletall = 3×10⁶- 1×10⁷
*Vi anbefaler å sende frosset cellelysat.I tilfelle den cellen teller mindre enn 5×10⁵, anbefales hurtigfryst i flytende nitrogen, som er å foretrekke for mikroekstraksjon.

Blodprøver:Volum ≥1 mL

Mikroorganisme:Masse ≥ 1 g

Anbefalt prøvelevering

Container:
2 ml sentrifugerør (tinnfolie anbefales ikke)
Prøvemerking: Gruppe+replikat f.eks. A1, A2, A3;B1, B2, B3... ...

Forsendelse:

1. Tørris: Prøver må pakkes i poser og begraves i tørris.
2. RNAstabile rør: RNA-prøver kan tørkes i RNA-stabiliseringsrør (f.eks. RNAstable®) og sendes i romtemperatur.

Servicearbeidsflyt

Eksperimentdesign

Prøvelevering

RNA-ekstraksjon

Bygging av bibliotek

Sekvensering

Dataanalyse

Ettersalgstjenester

Tidligere: Eukaryotisk mRNA-sekvensering-Illumina

Neste: Full-lengde mRNA-sekvensering-Nanopore

1.FLNC lengdefordeling

Lengden på ikke-kimerisk lesing i full lengde (FLNC) indikerer lengden på cDNA i bibliotekkonstruksjon.FLNC-lengdefordeling er en avgjørende indikator for å evaluere kvaliteten på bibliotekkonstruksjonen.

mRNA-FLNC-lese-lengde-fordeling

FLNC leselengdefordeling

2.Fullfør ORF-regionlengdefordeling

Vi bruker TransDecoder for å forutsi proteinkodende regioner og tilsvarende aminosyresekvenser for å generere unigen sett, som inneholder fullstendig ikke-redundant transkripsjonsinformasjon i alle prøver.

mRNA-fullstendig-ORF-lengde-fordeling

Fullstendig ORF-regionlengdefordeling

3.KEGG pathway anrikningsanalyse

Differensielt uttrykte transkripter (DETs) kan identifiseres ved å justere NGS-baserte RNA-sekvenseringsdata på full-lengde transkripsjonssett generert av PacBio-sekvenseringsdata.Disse DET-ene kan viderebehandles for ulike funksjonelle analyser, f.eks. KEGG-baneanrikningsanalyse.

mRNA-DEG-KEGG-pathway-anriking

DET KEGG baneberikelse -Prikkplott

BMK sak

Utviklingsdynamikken til Populus stammetranskriptom

Publisert: Plantebioteknologisk tidsskrift, 2019

Sekvenseringsstrategi:
Prøvesamling:stammeregioner: apex, første internode(IN1), andre internode(IN2), tredje internode(IN3), internode(IN4) og internode(IN5) fra Nanlin895
NGS-sekvens:RNA fra 15 individer ble samlet som én biologisk prøve.Tre biologiske replikater av hvert punkt ble behandlet for NGS-sekvens
TGS-sekvens:Stammeregioner ble delt inn i tre regioner, dvs. apex, IN1-IN3 og IN4-IN5.Hver region ble behandlet for PacBio-sekvensering med fire typer biblioteker: 0-1 kb, 1-2 kb, 2-3 kb og 3-10 kb.

Nøkkelresultater

1.Totalt 87150 full-lengde transkripsjoner ble identifisert, der 2081 nye isoformer og 62058 nye alternative spleisede isoformer ble identifisert.
2.1187 lncRNA og 356 fusjonsgener ble identifisert.
3. Fra primær vekst til sekundær vekst ble 15838 differensielt uttrykte transkripsjoner fra 995 differensielt uttrykte gener identifisert.I alle DEG-er var 1216 transkripsjonsfaktorer, hvorav de fleste ennå ikke er rapportert.
4.GO anrikningsanalyse avdekket viktigheten av celledeling og oksidasjonsreduksjonsprosess i primær og sekundær vekst.