Sekwencjonowanie RNA pojedynczego jądra
Schemat techniczny
Izolację jąder komórkowych uzyskuje się za pomocą 10× Genomics Chromium™, ośmiokanałowego systemu mikroprzepływowego z podwójnymi skrzyżowaniami. W tym systemie kulki żelowe z kodami kreskowymi i primerem, enzymami i pojedynczym jądrem komórkowym są zamknięte w nanolitrowej kropli oleju, tworząc żelowe kulki w emulsji (GEM). Po utworzeniu GEM, w każdej GEM przeprowadzana jest liza komórek i uwalnianie kodów kreskowych. mRNA jest poddawane odwrotnej transkrypcji do cząsteczek cDNA z kodami kreskowymi 10× i UMI, które następnie poddawane są standardowej konstrukcji biblioteki sekwencjonowania.
Cechy
● Przygotowanie zawiesiny pojedynczych jąder z zamrożonych tkanek
● Tworzenie kulek żelowych w emulsji (GEM) z następową syntezą cDNA
● Każda kulka w GEM jest wypełniona primerami składającymi się z 4 sekcji:
ogon poli(dT) do przygotowania mRNA i syntezy cDNA,
Unikalny identyfikator molekularny (UMI) korygujący odchylenia amplifikacji
10x kod kreskowy
Sekwencja wiążąca częściowo odczytanego 1 startera sekwencjonującego
Zalety
Sekwencjonowanie RNA pojedynczego jądra omija ograniczenia sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki, umożliwiając:
● Wykorzystanie zamrożonych próbek, a nie tylko świeżych
● Niski poziom stresu zamrożonych komórek w porównaniu z enzymatycznym traktowaniem świeżych komórek, co znajduje odzwierciedlenie w danych transkryptomu w postaci mniejszej liczby genów wywołanych stresem
● Brak konieczności wcześniejszego usunięcia czerwonych krwinek
● Nieograniczona średnica komórki
● Szeroka gama próbek kwalifikujących się do analizy, w tym złożone i delikatne typy tkanek, które są podatne na zlepianie się komórek lub ich niszczenie podczas rozpadu tkanki
Próbki, których nie można analizować metodą sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek i które kwalifikują się do analizy metodą sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder:
| Komórka / Tkanka | Powód |
| Nieświeża zamrożona tkanka | Nie można pobrać nowych lub długo zapisanych organizacji |
| Komórka mięśniowa, megakariocyt, tłuszcz… | Średnica komórki jest zbyt duża, aby mogła wejść do instrumentu |
| Wątroba… | Zbyt kruche, by je złamać, nierozróżnialne od pojedynczych komórek |
| Komórka neuronowa, mózg… | Większa czułość, łatwość narażenia na stres, zmieni wyniki sekwencjonowania |
| Trzustka, tarczyca… | Bogaty w endogenne enzymy, wpływające na produkcję zawiesiny pojedynczych komórek |
Pojedyncze jądro kontra pojedyncza komórka
| Pojedyncze jądro | Pojedyncza komórka |
| Nieograniczona średnica komórki | Średnica komórki: 10-40 μm |
| Materiał może być zamrożoną tkanką | Materiał musi być świeżą tkaniną |
| Niski poziom stresu zamrożonych komórek | Leczenie enzymatyczne może powodować reakcję stresową komórek |
| Nie ma potrzeby usuwania czerwonych krwinek | Należy usunąć czerwone krwinki |
| Jądrowy wyraża bioinformację | Cała komórka wyraża bioinformację |
Specyfikacje
| Przykładowe wymagania | Biblioteka | Strategia sekwencjonowania | Zalecane dane | Kontrola jakości |
| Tkanka zwierzęca ≥ 200 mg Tkanka roślinna ≥ 400 mg | Biblioteka 10x Genomics sn cDNA | Illumina PE150 | 100 tys. odczytów PE na komórkę (100-200 GB) | 700-1200 jąder/μl i integralność jąder obserwowana pod mikroskopem |
Aby uzyskać więcej szczegółów na temat wskazówek dotyczących przygotowania próbek i przebiegu prac serwisowych, prosimy o kontakt zEkspert BMKGENE
Przepływ pracy serwisowej
Zawiera następującą analizę:
● Kontrola jakości: liczba komórek, wykrywanie genów, dokładna identyfikacja komórek, cząsteczek RNA i kwantyfikacja ekspresji
● Analiza próbki wewnętrznej:
Klastrowanie komórek i adnotacje klastrów
Analiza ekspresji różnicowej: identyfikacja DEG w klastrach
Adnotacja funkcjonalna i wzbogacanie DEG klastra
● Analiza międzygrupowa:
Połączenie danych
Analiza ekspresji różnicowej: identyfikacja DEG w grupach
Adnotacja funkcjonalna i wzbogacanie grupowych DEG
● Zaawansowana analiza:
Analiza cyklu komórkowego
Analiza pseudoczasu
Analiza komunikacji komórkowej (CellPhoneDB)
Analiza wzbogacania zestawów genów (GSEA)
Analiza próbki wewnętrznej
Klastrowanie komórek:
Analiza ekspresji różnicowej: klastrowe DEGs
Analiza międzygrupowa
Analiza ekspresji różnicowej: Grupa DEGs
Zaawansowana analiza:
Analiza pseudoczasu:
Analiza cyklu komórkowego:
Zapoznaj się z postępem technicznym, jaki osiągnięto dzięki usługom sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra firmy BMKGene przy użyciu 10X Chromium w poniższych polecanych publikacjach:
Wang, L. i in. (2021) „Analiza transkryptomowa pojedynczych komórek ujawnia obraz immunologiczny płuc w zaostrzeniu astmy opornym na sterydy”,Materiały Narodowej Akademii Nauk Stanów Zjednoczonych Ameryki, 118(2), s. e2005590118. doi: 10.1073/pnas.2005590118
Zheng, H. i in. (2022) „Globalna sieć regulacyjna dla zaburzonej ekspresji genów i nieprawidłowej sygnalizacji metabolicznej w komórkach układu odpornościowego w mikrośrodowisku choroby Gravesa-Basedowa i zapalenia tarczycy Hashimoto”,Granice immunologii, 13, s. 879824. doi: 10.3389/FIMMU.2022.879824/BIBTEX.
Tian, H. i in. (2023) „Transkryptom pojedynczej komórki ujawnia heterogeniczność i reakcje immunologiczne leukocytów po szczepieniu inaktywowanym Edwardsiella tarda u flądry (Paralichthys olivaceus)”,Akwakultura, 566, s. 739238. doi: 10.1016/J.AQUACULTURE.2023.739238.
Yu, Y. i in. (2023) „Terapia fotodynamiczna poprawia wyniki leczenia inhibitorami punktów kontrolnych układu odpornościowego poprzez przebudowę odporności przeciwnowotworowej u pacjentów z rakiem żołądka”,Rak żołądka, 26(5), s. 798–813. doi: 10.1007/S10120-023-01409-X/METRICS.
