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Sequenciamento completo de mRNA -PacBio

De novosequenciamento completo do transcriptoma, também conhecido comoDe novoO Iso-Seq aproveita as vantagens do sequenciador PacBio no comprimento de leitura, o que permite o sequenciamento de moléculas de cDNA completas sem quebras.Isso evita completamente quaisquer erros gerados nas etapas de montagem da transcrição e constrói conjuntos unigênicos com resolução em nível de isoforma.Esses conjuntos unigênicos fornecem informações genéticas poderosas como “genoma de referência” no nível do transcriptoma.Além disso, combinado com dados de sequenciamento de próxima geração, este serviço permite uma quantificação precisa da expressão em nível de isoforma.

Plataforma: PacBio Sequel II
Biblioteca: biblioteca de sinos SMRT

  • :
  • Detalhes do serviço

    Resultados de demonstração

    Estudo de caso

    Vantagens do serviço

    2

    ● Leitura direta da molécula de cDNA completa da extremidade 3' à extremidade 5'

    ● Resolução em nível de forma iso na estrutura de sequência

    ● Transcrições com alta precisão e integridade

    ● Altamente compatível com várias espécies

    ● Grande capacidade de sequenciamento com 4 plataformas de sequenciamento PacBio Sequel II equipadas

    ● Altamente experiente em mais de 700 projetos de sequenciamento de RNA baseados em Pacbio

    ● Entrega de resultados baseada em BMKCloud: mineração de dados personalizada disponível na plataforma.

    ● Serviços pós-venda válidos por 3 meses após a conclusão do projeto

    Especificações de serviço

    Plataforma: PacBio Sequel II

    Biblioteca de sequenciamento: biblioteca de mRNA enriquecida com Poly A

    Rendimento de dados recomendado: 20 Gb/amostra (dependendo da espécie)

    FLNC(%): ≥75%

    *FLNC: transcrições não quiméricas completas

    Análises de bioinformática

    ● Processamento de dados brutos
     
    ● Identificação da transcrição
     
    ● Estrutura de sequência
     
    ● Quantificação de Expressão
     
    ● Anotação de Função

    pacbio completo

    Requisitos de amostra e entrega

    Requisitos de amostra:

    Nucleotídeos:

    Conc.(ng/μl)

    Quantidade (μg)

    Pureza

    Integridade

    ≥ 120

    ≥ 0,6

    DO260/280=1,7-2,5

    DO260/230=0,5-2,5

    Contaminação limitada ou inexistente de proteínas ou DNA mostrada no gel.

    Para plantas: RIN≥7,5;

    Para animais: RIN≥8,0;

    5,0≥ 28S/18S≥1,0;

    elevação limitada ou nenhuma elevação da linha de base

    Tecido: Peso (seco):≥1g
    *Para tecidos menores que 5 mg, recomendamos o envio de amostra de tecido congelado (em nitrogênio líquido).

    Suspensão celular:Contagem de células = 3×106- 1×107
    *Recomendamos enviar lisado celular congelado.Caso a contagem de células seja menor que 5×105, recomenda-se o congelamento instantâneo em nitrogênio líquido, que é preferível para microextração.

    Amostras de sangue:Volume≥1 mL

    Microrganismo:Massa ≥ 1g

    Entrega de amostra recomendada

    Recipiente:
    Tubo de centrífuga de 2 ml (folha de estanho não é recomendada)
    Rotulagem da amostra: Grupo+réplica, por exemplo, A1, A2, A3;B1, B2, B3... ...

    Envio:

    1. Gelo seco: As amostras precisam ser embaladas em sacos e enterradas em gelo seco.
    2. Tubos RNAstable: As amostras de RNA podem ser secas em tubo de estabilização de RNA (por exemplo, RNAstable®) e enviadas em temperatura ambiente.

    Fluxo de trabalho de serviço

    CQ de amostra

    Projeto de experimento

    entrega de amostra

    Entrega de amostra

    Experiência piloto

    Extração de RNA

    Preparação da Biblioteca

    Construção de biblioteca

    Sequenciamento

    Sequenciamento

    Análise de dados

    Análise de dados

    Serviços pós-venda

    Serviços pós-venda


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  • Próximo:

  • 1. Distribuição de comprimento FLNC

    O comprimento da leitura não quimérica completa (FLNC) indica o comprimento do cDNA na construção da biblioteca.A distribuição de comprimento FLNC é um indicador crucial na avaliação da qualidade da construção de bibliotecas.

    Distribuição de comprimento de leitura de mRNA-FLNC

    Distribuição de comprimento de leitura FLNC

    2. Distribuição completa do comprimento da região ORF

    Usamos o TransDecoder para prever regiões codificadoras de proteínas e sequências de aminoácidos correspondentes para gerar conjuntos unigenes, que contêm informações transcritas completas e não redundantes em todas as amostras.

    Distribuição de comprimento de ORF completo de mRNA

    Distribuição completa do comprimento da região ORF

    3. Análise de enriquecimento da via KEGG

    Transcrições diferencialmente expressas (DETs) podem ser identificadas alinhando dados de sequenciamento de RNA baseados em NGS em conjuntos de transcrições completos gerados por dados de sequenciamento PacBio.Esses DETs podem ser processados ​​posteriormente para diversas análises funcionais, por exemplo, análise de enriquecimento da via KEGG.

    Enriquecimento da via mRNA-DEG-KEGG

    Enriquecimento da via DET KEGG - Gráfico de pontos

    Caso BMK

    A dinâmica de desenvolvimento do transcriptoma do caule de Populus

    Publicados: Revista de Biotecnologia Vegetal, 2019

    Estratégia de sequenciamento:
    Coleta de amostras:regiões do caule: ápice, primeiro entrenó (IN1), segundo entrenó (IN2), terceiro entrenó (IN3), entrenó (IN4) e entrenó (IN5) de Nanlin895
    Sequência NGS:RNA de 15 indivíduos foram reunidos como uma amostra biológica.Três réplicas biológicas de cada ponto foram processadas para a sequência NGS
    Sequência TGS:As regiões do caule foram divididas em três regiões, ou seja, ápice, IN1-IN3 e IN4-IN5.Cada região foi processada para sequenciamento PacBio com quatro tipos de bibliotecas: 0-1 kb, 1-2 kb, 2-3 kb e 3-10 kb.

    Principais resultados

    1. Foram identificados um total de 87.150 transcrições completas, nas quais foram identificadas 2.081 novas isoformas e 62.058 novas isoformas de splicing alternativo.
    Foram identificados 2.1187 lncRNA e 356 genes de fusão.
    3. Do crescimento primário ao crescimento secundário, foram identificados 15.838 transcritos expressos diferencialmente de 995 genes expressos diferencialmente.Em todos os DEGs, 1.216 eram fatores de transcrição, a maioria dos quais ainda não foi relatada.
    A análise de enriquecimento 4.GO revelou a importância da divisão celular e do processo de redução da oxidação no crescimento primário e secundário.

    • Estudo de caso de sequenciamento de RNA de comprimento total PB

      Eventos de splicing alternativos e diferentes isoformas

    • Splicing alternativo de RNA de comprimento total PB

      Análise WGCNA sobre fatores de transcrição

    Referência

    Chao Q, Gao ZF, Zhang D, et al.A dinâmica de desenvolvimento do transcriptoma do caule de Populus.Plant Biotechnol J. 2019;17(1):206-219.doi:10.1111/pbi.12958

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