Alaabta

Taxanaha mRNA dhererka buuxa -PacBio

Isku xigxiga mRNA dhererkiisu dhan yahay -PacBio Sawirka sifaysan

De novoisku xigxiga qoraalka qoraalka dhererka buuxa, oo sidoo kale loo yaqaanDe novoIso-Seq waxay ku qaadataa faa'iidooyinka taxanaha PacBio dhererka akhrinta, kaas oo awood u siinaya isku xigxiga molecules cDNA oo buuxa iyada oo aan wax nasasho ah la helin.Tani waxay gabi ahaanba ka fogaataa wixii khaladaad ah ee ka dhasha talaabooyinka isu imaatinka qoraalka waxayna dhistaa jaangooyo unigene oo leh xallinta heerka isoform.Qaybaha unigene-kan ayaa bixiya macluumaadka hidde-sidaha awood leh sida "genome tixraac" oo ah heerka transcriptome.Intaa waxaa dheer, isku darka xogta isku xigxiga jiilka soo socda, adeeggani waxa uu awood siinayaa qiyaas sax ah ee muujinta heerka isoform-ka.

Platform: PacBio Sequel II

Maktabadda: maktabadda gambaleelka SMRT

Nala soo xiriir

Faahfaahinta Adeegga

Natiijooyinka Demo

Kiis barasho

Faa'iidooyinka Adeegga

● Akhrinta tooska ah ee molecule cDNA oo buuxa laga bilaabo 3'-dhamaadka ilaa 5'--dhamaadka

● Xallinta heerka iso-form ee qaabka isku xigxiga

● Qoraallo leh saxnaan sare iyo daacadnimo

● Aad ugu habboon noocyada kala duwan

● Awood isku xigxig weyn oo leh 4 PacBio Sequel II ee aaladaha isku xigxiga oo qalabaysan

● Khibrad sare leh oo leh in ka badan 700 mashruuc oo isku xigxiga RNA oo ku salaysan Pacbio

● Gaadhista natiijada ku salaysan BMKCloud: Macdanta habaysan ee laga heli karo goobta.

● Adeegyada iibka kadib waxay shaqaynayaan 3 bilood marka mashruuca la dhammeeyo

Tilmaamaha Adeegga

Platform: PacBio Sequel II

Maktabadda isku xigxiga: Poly A- maktabadda mRNA ee la xoojiyey

Soo-saarka xogta lagu taliyay: 20 Gb/ muunad (waxay kuxirantahay noocyada)

FLNC (%): ≥75%

*FLNC: Qoraallada aan kimeric-ka ahayn ee dhererkoodu dhan yahay

Falanqaynta bioinformatics

● Habaynta xogta ceeriin

● Aqoonsiga qoraalka

● Qaabka isku xigxiga

● Qiyaasta muujinta

● Sharaxaada shaqada

Tusaalaha Shuruudaha iyo Bixinta

Tusaalaha Shuruudaha:

Nucleotides:

Conc.(ng/μl)

Qadarka (μg)

daahirnimo

Daacadnimo

≥ 120

≥ 0.6

OD260/280=1.7-2.5

OD260/230=0.5-2.5

Xaddidan ama aan lahayn borotiin ama wasakh DNA oo lagu muujiyey jel.

Dhirta: RIN≥7.5;

Xoolaha: RIN≥8.0;

5.0≥ 28S/18S≥1.0;

xaddidan ama aan lahayn sare u qaadis aasaasi ah

Nudaha: Miisaanka (qallalan):≥1 g
* Unugyada ka yar 5 mg, waxaan kugula talineynaa inaad soo dirto muunada nudaha barafaysan (ku jira nitrogen dareere ah).

Ka joojinta unugga:Tirada unugyada = 3×10⁶- 1×10⁷
* Waxaan kugula talineynaa in la raro unugyada la qaboojiyey.Haddii unuggaasi uu ka yar yahay 5×10⁵, Tooshka barafaysan ee dareeraha nitrogen ayaa lagula talinayaa, taas oo doorbidaysa soo saarista yar yar.

Muunadaha dhiigga:Mugga ≥1 mL

Microorganism:Cuf ≥ 1 g

Tusaalaha keenista lagu taliyay

Konteenar:
2 ml oo tuubo sentrifuge ah (Faylada qasacadaysan laguma talinayo)
Tusaalaha calaamadaynta: Kooxda+ku celcelinta tusaale A1, A2, A3;B1, B2, B3......

Raritaanka:

1. Barafka qallalan: Muunadodu waxay u baahan yihiin in lagu xidho bac oo lagu aaso baraf qallalan.
2. Tuubooyinka RNAstable: Muunada RNA waxaa lagu qallajin karaa tuubada xasilinta RNA (tusaale RNAstable®) waxaana lagu rari karaa heerkulka qolka.

Socodka Shaqada Adeegga

Naqshadaynta tijaabada

Tusaalaha keenista

soo saarista RNA

Dhismaha maktabadda

Isku xigxiga

Falanqaynta xogta

Adeegyada iibka kadib

Hore: Eukaryotic mRNA Sequencing-Illumina

Xiga: Dherer buuxa mRNA Taxane-Nanopore

1.FLNC dhererka qaybinta

Dhererka dhererka buuxa ee akhrinta aan kimeric ahayn(FLNC) waxay muujinaysaa dhererka cDNA ee dhismaha maktabadda.Qaybinta dhererka FLNC waa tilmaame muhim ah oo lagu qiimeeyo tayada dhismaha maktabadda.

mRNA-FLNC-akhrinta-dhererka-qaybinta

FLNC akhriska dhererka qaybinta

2.Dhamaystiran qaybinta dhererka gobolka ORF

Waxaan u isticmaalnaa TransDecoder si aan u saadaalino gobollada koodka borotiinka iyo taxanaha amino acid ee u dhigma si loo soo saaro unugyo unugyo ah, kaas oo ka kooban macluumaad qoraal ah oo dhammaystiran oo aan soo noqnoqon oo dhammaan muunadaha.

qaybinta dhererka mRNA-Dhamays-ORF

Dhameystiran qaybinta dhererka gobolka ORF

3.KEGG falanqaynta kobcinta dariiqa

Qoraalada kala duwan ee la soo bandhigay (DETs) waxaa lagu aqoonsan karaa iyadoo la isku toosiyo xogta isku xigxiga ee NGS-ku salaysan ee qoraalka qoraalka dhererka buuxa ee ay soo saartay xogta isku xigxiga ee PacBio.DET-yadan waxaa loo sii baaraandegi karaa falanqaynta hawleed ee kala duwan, tusaale ahaan falanqaynta kobcinta dariiqa KEGG.

mRNA-DEG-KEGG-dariiqa-kordhinta

DET KEGG tayeynta dariiqa -Dhiqadda dhibicda

Kiiska BMK

Dhaqdhaqaaqa korriinka ee Populus stem transcriptome

La daabacay: Wargeyska Biotechnology ee dhirta, 2019

Istaraatiijiyada isku xigxiga:
Tusaalaha ururinta:gobollada asliga ah: cirifka, internode koowaad (IN1), internode labaad (IN2), internode saddexaad (IN3), internode (IN4) iyo internode (IN5) laga bilaabo Nanlin895
NGS-taxane:RNA oo ka kooban 15 qof ayaa la isugu geeyay sidii hal muunado noole.Saddex nooc oo bayooloji ah oo dhibco kasta ah ayaa loo habeeyey isku xigxiga NGS
TGS-taxane:Gobollada jirida waxaa loo qaybiyay saddex gobol, tusaale ahaan, IN1-IN3 iyo IN4-IN5.Gobol kasta waxaa loo habeeyey isku xigxiga PacBio oo leh afar nooc oo maktabado ah: 0-1 kb, 1-2 kb, 2-3 kb iyo 3-10 kb.

Natiijooyinka muhiimka ah

1. Wadar dhan 87150 qoraallo dhererkoodu dhan yahay ayaa la aqoonsaday, kuwaas oo, 2081 isoforms novel ah iyo 62058 novel beddelka isoforms kala go'ay lagu aqoonsaday.
2.1187 lncRNA iyo 356 hiddo-wadaha fiyuuska ayaa la aqoonsaday.
3. Laga soo bilaabo kobaca asaasiga ah ilaa kobaca sare, 15838 si kala duwan ayaa loo muujiyay qoraallada laga soo bilaabo 995 hidde-sidaha kala duwan ayaa la aqoonsaday.Dhammaan DEGs-yada, 1216 waxay ahaayeen arrimo qoraal ah, kuwaas oo intooda badan aan weli la soo sheegin.
Falanqaynta kobcinta 4.GO ayaa shaaca ka qaaday muhiimada qaybta unugyada iyo habka dhimista oksaydhka ee kobaca asaasiga ah iyo sare.