Sekuenca e mARN-së me gjatësi të plotë -PacBio
Avantazhet e Shërbimit
● Leximi i drejtpërdrejtë i molekulës së cADN-së me gjatësi të plotë nga fundi 3' deri në fundin 5'
● Rezolucioni i nivelit të formës iso në strukturën e sekuencës
● Transkriptet me saktësi dhe integritet të lartë
● Shumë i pajtueshëm me speciet vaiours
● Kapacitet i madh sekuencimi me 4 platforma të sekuencimit PacBio Sequel II të pajisura
● Shumë përvojë me mbi 700 projekte të sekuencës së ARN-së me bazë Pacbio
● Dorëzimi i rezultateve të bazuara në BMKCloud: Ekspozimi i personalizuar i të dhënave është i disponueshëm në platformë.
● Shërbimet pas shitjes të vlefshme për 3 muaj pas përfundimit të projektit
Specifikimet e Shërbimit
Platforma: PacBio Sequel II
Biblioteka e renditjes: Biblioteka mRNA e pasuruar me Poly A
Rendimenti i rekomanduar i të dhënave: 20 Gb/kampion (në varësi të specieve)
FLNC (%): ≥75%
*FLNC: Transcipte jo-kimerike me gjatësi të plotë
Analizat bioinformatike
● Përpunimi i të dhënave të papërpunuara
● Identifikimi i transkriptit
● Struktura e sekuencës
● Kuantifikimi i shprehjes
● Shënimi i funksionit
Kërkesat e mostrës dhe dorëzimi
Kërkesat e mostrës:
Nukleotidet:
| Konk.(ng/μl) | Sasia (μg) | Pastërti | Integriteti |
| ≥ 120 | ≥ 0.6 | OD260/280=1,7-2,5 OD260/230=0,5-2,5 Ndotje e kufizuar ose pa proteina ose ADN e treguar në xhel. | Për bimët: RIN≥7.5; Për kafshët: RIN≥8.0; 5,0≥ 28S/18S≥1,0; lartësi bazë e kufizuar ose aspak |
Indi: Pesha (e thatë):≥1 g
*Për indet më të vogla se 5 mg, rekomandojmë dërgimin e mostrës së indit të ngrirë (në azot të lëngshëm).
Pezullimi i qelizave:Numri i qelizave = 3×106- 1×107
*Ne rekomandojmë dërgimin e lizatit të qelizave të ngrira.Në rast se ajo qelizë numërohet më e vogël se 5×105Rekomandohet i ngrirë në azot të lëngshëm, i cili preferohet për mikroekstraktim.
Mostrat e gjakut:Vëllimi≥1 mL
Mikroorganizmi:Masa ≥ 1 g
Dorëzimi i mostrës së rekomanduar
Enë:
Tub centrifuge 2 ml (Folja e kallajit nuk rekomandohet)
Etiketimi i mostrës: Grup+përsëritje p.sh. A1, A2, A3;B1, B2, B3 ... ...
Dërgesa:
1. Akull i thatë: Mostrat duhet të paketohen në thasë dhe të varrosen në akull të thatë.
2. Tubat e qëndrueshëm me ARN: Mostrat e ARN-së mund të thahen në tubin e stabilizimit të ARN-së (p.sh. RNAstable®) dhe të dërgohen në temperaturën e dhomës.
Rrjedha e punës së shërbimit
Dizajni i eksperimentit
Dorëzimi i mostrës
Ekstraktimi i ARN-së
Ndërtimi i bibliotekës
Sekuenca
Analiza e të dhënave
Shërbimet pas shitjes
1.Shpërndarja e gjatësisë FLNC
Gjatësia e leximit jo-kimerik me gjatësi të plotë (FLNC) tregon gjatësinë e cDNA në ndërtimin e bibliotekës.Shpërndarja e gjatësisë së FLNC është një tregues vendimtar në vlerësimin e cilësisë së ndërtimit të bibliotekës.
Shpërndarja e gjatësisë së leximit FLNC
2.Shpërndarja e plotë e gjatësisë së rajonit ORF
Ne përdorim TransDecoder për të parashikuar rajonet e kodimit të proteinave dhe sekuencat përkatëse të aminoacideve për të gjeneruar grupe unigjene, të cilat përmbajnë informacion të plotë të transkriptit jo të tepërt në të gjitha mostrat.
Shpërndarja e plotë e gjatësisë së rajonit ORF
3.Analiza e pasurimit të rrugës KEGG
Transkriptet e shprehura në mënyrë diferenciale (DET) mund të identifikohen duke përafruar të dhënat e sekuencës së ARN-së të bazuara në NGS në grupet e transkripteve me gjatësi të plotë të krijuara nga të dhënat e sekuencës PacBio.Këto DET mund të përpunohen më tej për analiza të ndryshme funksionale, p.sh. analiza e pasurimit të rrugës KEGG.
Pasurimi i shtegut DET KEGG - Komploti me pika
Rasti BMK
Dinamika e zhvillimit të transkriptomës së rrjedhës Populus
Publikuar: Revista e Bioteknologjisë së Bimëve, 2019
Strategjia e renditjes:
Mbledhja e mostrës:rajonet rrjedhëse: kulmi, ndërnyja e parë (IN1), ndërnyja e dytë (IN2), ndërnyja e tretë (IN3), ndërnyja (IN4) dhe ndërnyja (IN5) nga Nanlin895
Sekuenca NGS:ARN prej 15 individësh u grumbulluan si një mostër biologjike.Tre kopje biologjike të secilës pikë u përpunuan për sekuencën NGS
Sekuenca TGS:Rajonet e rrjedhjes u ndanë në tre rajone, gjegjësisht kulmin, IN1-IN3 dhe IN4-IN5.Çdo rajon u përpunua për renditjen e PacBio me katër lloje bibliotekash: 0-1 kb, 1-2 kb, 2-3 kb dhe 3-10 kb.
Rezultatet kryesore
1. Janë identifikuar gjithsej 87150 transkripta të plota, në të cilat janë identifikuar 2081 izoforma të reja dhe 62058 izoforma alternative të reja të bashkuara.
U identifikuan 2.1187 lncARN dhe 356 gjene të bashkimit.
3. Nga rritja primare në rritjen dytësore, u identifikuan 15838 transkripte të shprehura në mënyrë diferenciale nga 995 gjene të shprehura në mënyrë diferenciale.Në të gjitha DEG-të, 1216 ishin faktorë transkriptimi, shumica e të cilëve nuk janë raportuar ende.
Analiza e pasurimit 4.GO zbuloi rëndësinë e ndarjes së qelizave dhe procesit të reduktimit të oksidimit në rritjen parësore dhe dytësore.
Ngjarjet alternative të bashkimit dhe izoformat e ndryshme
Analiza e WGCNA mbi faktorët e transkriptimit
Referenca
Chao Q, Gao ZF, Zhang D, etj.Dinamika e zhvillimit të transkriptomës së rrjedhës Populus.Bioteknoli i bimëve J. 2019; 17 (1): 206-219.doi: 10.1111/pbi.12958
